Antoshka

Путь к Файлу: /Пищевая химия для заочного / методичка по пищевой химии часть 1.doc

Ознакомиться или скачать весь учебный материал данного пользователя
Скачиваний:   6
Пользователь:   Antoshka
Добавлен:   28.10.2014
Размер:   9.9 МБ
СКАЧАТЬ

 

 
ФГОУ ВПО

«КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

 

Кафедра технологии хранения и переработки

растениеводческой продукции

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

 

к лабораторно - практическим занятиям по дисциплине

«Пищевая химия»

 

по теме: « Белки »

 

 

 

для студентов, обучающихся по специальности 311200

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Краснодар 2007


 

 

 
 

 

 

 

 

 

 


методичка по пищевой химии часть 1Одобрены на заседании методической комиссии факультета перерабатывающих технологий (протокол №  от «    _»        _____ 2007 г.)

 

 

Методические указания подготовили: профессор, к.т.н. Щербакова Е.В.

доцент, к.т.н. Кондратенко В.В.

         ассистент Кондратенко Т.Ю.

         соискатель Чубит Л.Ю.

        

 

Рецензент – профессор, д.т.н. Донченко Л.В.

 


ВВЕДЕНИЕ

 

Белки – это природные высокомолекулярные соединения (биополимеры) структурную основу которых составляют полипептидные цепи, построенные из остатков альфа-аминокислот.

Цепь, состоящую из большого числа соединённых друг с другом аминокислотных остатков, называют полипептидной. В состав полипептидной цепи входят десятки и сотни аминокислотных остатков. Следовательно, молекулы белков различаются не только составом аминокислот, их числом и последовательностью, но и длиной полипептидной цепи. Одни белки содержат одну полипептидную цепь, а другие – несколько.

Все жизненные процессы в организме человека находятся в большой зависимости от того, из чего составляется его питание с первых дней жизни, а также от режима питания. Всякий живой организм в процессе жизнедеятельности непрерывно тратит входящие в его состав вещества. Значительная часть этих веществ «сжигается» (окисляется) в организме, в результате чего освобождается энергия. Эту энергию организм использует для поддержания постоянной температуры тела, для обеспечения нормальной деятельности внутренних органов (сердца, дыхательного аппарата, органов кровообращения, нервной системы и т.д.) и особенно для выполнения физической работы. Кроме того, в организме постоянно протекают созидательные, так называемые пластичные процессы, связанные с формированием новых клеток и тканей. Для поддержания жизни необходимо, чтобы все эти траты организма полностью возмещались. Источником такого возмещения являются вещества, поступающие с пищей.

Потребность в белках у человека зависит от его возраста, вида деятельности, от состояния организма. От количества и качества белков зависит рост и развитие растущего организма. Потребность ребёнка в белках зависит не только от возраста, но и от состояния организма, от перенесённых инфекционных заболеваний и от условий питания с первых месяцев жизни. Дети, отстающие в физическом развитии, нуждаются в больших количествах белков, чем дети развивающиеся нормально.

В питании самых маленьких детей количество белков животного происхождения достигают почти 100%, для детей от 1 года до 3х лет – 75%, для всех детей и подростков это количество не должно быть ниже 50%. Взрослому человеку необходимо, чтобы количество белков из животных продуктов составляло не менее 30%.

Необходимо, чтобы белки были в правильных соотношениях с другими пищевыми веществами – с углеводами. Жирами, витаминами. При отсутствии или недостаточном содержании в пище углеводов, жиров или витаминов в организме значительно усиливаются процессы расщепления белков, и рекомендуемые нормы суточного потребления белков могут оказаться недостаточными.

Белки подразделяются на две большие группы: простые белки, или протеины и сложные белки, или протеиды (рисунок 1).

 


методичка по пищевой химии часть 1

 

 
 

 



Лабораторная работа № 1

 

ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВ

 

Реактивы и оборудование: раствор яичного белка; концентрированная соляная кислота (HCL конц.); 30%-ный едкий натр (NaOH); 1%-ный сульфат меди; пекарские дрожжи; 10%-ная серная кислота (H2SO4); 10%-ный и 30%-ный едкий натр; 1%-ный и 7%-ный сульфат меди; 1%-ный раствор виннокислого натрия и калия; молибденовый реактив; аммиачный раствор серебра; 10% раствор аммиака; стеклянные пробирки на мл; держатели для пробирок; штативы для пробирок; карандаш по стеклу; фильтры; воронки; пипетки градуированные на 1;2;5;8 мл; резиновые пробки со стеклянными трубками; стеклянный стакан на 50 мл; шпатели; лакмусовая бумага; весы; водяная баня.

 

1). Гидролиз яичного белка.

 

Гидролиз белка связан с разрывом пептидных связей в молекуле белка и присоединением воды по месту разрыва.

Гидролиз белка можно осуществить при длительном кипячении в концентрированных растворах кислот и щелочей, а также ферментативным путём.

При гидролизе белки сначала распадаются на полипептиды, пептоны, три- и дипептиды, а затем на аминокислоты.

Чаще всего гидролиз (рисунок 2) осуществляют кипячением с соляной кислотой, но для полного гидролиза кипятить белок нужно в течение 12-70 часов, в зависимости от белка (т.е. от длины белковой цепочки). Полный гидролиз белков может осуществляться с гидроксидами щелочных металлов.

Однако, щелочной гидролиз страдает рядом недостатков, например, происходит дезаминирование (отщепление) некоторой аминной группы от аминокислот, а также разложение аргинина на оргинин и мочевину, а также разрушение цистина и цистеина. Полный гидролиз белков можно провести, как указано выше при помощи протеолитических ферментов в очень мягких условиях (температура-20-300 С.; рН среды - ближе к нейтральной).

 

Ход работы:

 

1.1. В термостойкую пробирку отмеривают 2мл раствора яичного белка и 5 мл концентрированной соляной кислоты. Пробирку закрывают резиновой пробкой с длинной стеклянной трубкой и кипятят на водяной бане в течение двух часов.

2.1. Через каждые 30 мин после начала гидролиза из пробирки, где происходит гидролиз, отливают 1мл гидролизата в мерную пробирку.

3.1. С 1мл охлаждённого гидролизата проделывают биуретовую реакцию. Для этого к 1мл гидролизата добавляют 2мл 30%-ного раствора едкого натра и 1 мл 1%-ного сульфата меди.


 

методичка по пищевой химии часть 1
4.1. Для выявления разницы в окраске, которую дают продукты гидролиза белка с биуретовым реактивом, проводят биуретовую реакцию с 1 мл раствора яичного альбумина.

Наличие окраски свидетельствует о присутствии в растворе свободной аминокислоты, а интенсивность окраски свидетельствует о концентрации аминокислот в растворе (т.е. чем выше концентрация аминокислот, тем полнее прошел гидролиз).

5.1. Отмечают окраску полученных растворов и делают выводы.

Оформление полученных результатов: Записать результаты биуретовой реакции, проделанной с белком и разными по времени гидролиза порциям гидролизата.

 

2). Гидролиз нуклеопротеидов дрожжей.

 

Нуклеопротеиды - это сложные белки, состоящие из простых белков гистонов, проламинов и нуклеиновых кислот РНК и ДНК.

Нуклеиновые кислоты – это полинуклеотид, состоящий из большого количества мононуклеотидов.

Мононуклеотиды – сложные соединения, состоящие из пуриновых и пиримидиновых оснований, углеводов (рибоза и дезоксирибоза) и связанной с ними фосфорной кислоты.

Различают два типа нуклеиновых кислот: рибонуклеиновую (РНК) и дезоксирибонуклеиновую (ДНК). В состав первой входит рибоза, второй- дезоксирибоза. Установлено, что ДНК является важной составной частью клеточных ядер, а РНК в основном входит в состав протоплазмы клеток.

Соединение, состоящее из того или иного пуринового или пиримидинового основания, связанного с углеводом называется нуклеозидом.

Нуклеопротеидами особенно богаты дрожжи, бактериальные ткани растений, животных, а также ткани находящиеся в состоянии активного роста.

Получение нуклеопротеидов основано на их растворимости в щелочной среде и на осаждении слабыми кислотами.

При кипячении с разведёнными кислотами наблюдается полный и частичный гидролиз.

Частичный гидролиз проводят путем кипячения препарата с раствором Н2SO4 в течение 1 часа (пункт 2.1).

При этом в начале гидролиза от небелкового компонента (нуклеиновая кислота) отщепляется белок, который затем подвергают частичному расщеплению, нуклеиновая же кислота далее распадается на мононуклеотиды, а от последних отщепляются пуриновые основания (аденин и гуанин), фосфорная кислота и частично пентоза. Отщепление же пиримидиновых оснований идёт только при глубоком гидролизе.

Таким образом, с целью изучения химического состава нуклеопротеидов проводят кислотный гидролиз дрожжей и открывают при помощи качественных реакций продукты гидролиза – полипептиды, азотистые основания, углеводы, пентозу и фосфорную кислоту.

Ход работы:

 

2.1. Гидролиз.

 

В термостойкую пробирку помещают 1г свежих пекарских дрожжей и добавляют осторожно 8 мл 10%-ного раствора серной кислоты. Пробирку закрывают пробкой, в которую в качестве воздушного холодильника вставляют стеклянную трубку длиной 25-30 см и ставят пробирку в водяную баню (рисунок 3).

Через час от начала кипения смеси гидролиз прекращают, охлаждают пробирку холодной водой и фильтруют содержимое пробирки, через вату в другую пробирку. В полученном фильтрате открывают химические компоненты, полученные при гидролизе нуклеопротеидов (аминокислоты).

 

2.2. Биуретовая реакция на полипептиды.

 

К 1 мл гидролизата добавляют 2 мл 10%-ного раствора едкого натра и 1-2 капли 1%-ного сульфата меди. Жидкость окрашивается в фиолетовый цвет.

 

2.3. Качественные реакции на рибозу и дезоксирибозу.

 

Эти реакции основаны на способности рибозы и дезоксирибозы, имеющих альдегидные группы, восстанавливать соли металлов (меди, серебра, железа и т.д.) в щелочной среде. Сахара же при этом дают различные продукты окисления: рибоновую или дезоксирибоновую кислоты.

 

Реакция протекает согласно уравнению:

методичка по пищевой химии часть 1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


 

методичка по пищевой химии часть 1


К 1 мл гидролизата добавляют 1 мл 30%-ного раствора едкого натра и 1 мл 7%-ного раствора сульфата меди до появления неисчезающего осадка гидроксида меди (Сu (OH)3).

Жидкость перемешивают и нагревают до кипения. Выпадает жёлтый осадок гидроксида меди или красный осадок оксида меди (СuO).

 

2.4. Проба на пуриновые основания.

 

К 1 мл гидролизата добавляют 5 капель 10%-ного раствора аммиака до щелочной реакции (на лакмус) и затем добавляют 0,5мл аммиачного раствора оксида серебра.

Выпадает хлопьевидный осадок серебряных солей пуриновых оснований, который постепенно оседает на дно пробирки.

методичка по пищевой химии часть 1

 

 

 

 

 

 

 

 

2.5. Молибденовая проба на фосфорную кислоту.

 

К 2 мл молибденового реактива добавляют 1 мл гидролизата дрожжей, смесь слегка подогревают на водяной бане. Затем пробирку охлаждают под струёй холодной воды и наблюдают выпадение жёлтого кристаллического осадка комплексного соединения фосфорномолибденового аммония, указывающего на присутствие в гидролизате фосфорной кислоты. При этом жидкость в пробирке, окрашивается в лимонно-жёлтый цвет.

 

методичка по пищевой химии часть 1

 

 

 

Таблица 1 – Параметры проведения процесса гидролиза

 

Параметры

Образец № 1

Образец № 2

1

2

3

Вид сырья

Яичный белок

Дрожжи пекарские

Вид гидролизующего агента

HCL

H2SO4

Концентрация гидролизующего агента

Концентрированная

10%

Гидромодуль (q)

2:5

1:8

Температура

60-70оС

70-90 оС

Время

2

1

Контрольные вопросы

 

1. Что такое гидролиз белков? В чем химическая сущность гидролиза?

2. В каких условиях идёт гидролиз белка?

3. Какие структуры белковой молекулы нарушаются при гидролизе?

4. Назовите промежуточные и конечные продукты гидролиза белков?

5. Что такое сложные белки? Назовите классы сложных белков.

6. Назовите продукты гидролиза нуклеопротеидов.

7. Какие углеводы входят в структуру нуклеопротеидов, и какими качественными реакциями их открывают?

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14.

 


Лабораторная работа № 2

 

ИЗОЭЛЕКТРИЧЕСКАЯ ТОЧКА БЕЛКОВ

 

Цель занятия:

 

Реактивы и оборудование:

 

Белки благодаря присутствию в их составе аминных и карбоксильных групп, существуют в растворах в виде двухзарядных частиц (рисунок 4).

методичка по пищевой химии часть 1

методичка по пищевой химии часть 1

 

 

Рисунок 4 – Строение биполярного иона белка

 
 

 

 


В зависимости от количества в белке аминных или карбоксильных групп его молекула в водном растворе приобретает тот или иной заряд. Большинство белков животного происхождения содержит в своем составе больше дикарбоновых, чем диаминокислот и поэтому в целом они заряжаются отрицательно (белки-анионы), некоторые белки имеют в своём составе избыток диаминокислот и заряжены в целом положительно (белки-катионы). Одноименный заряд белковых молекул способствует взаимному отталкиванию частиц, что обеспечивает устойчивость их в растворе.

Число ионизированных групп в белке может быть увеличено или уменьшено при изменении среды. В кислой среде подавляется диссоциация карбоксильных групп и суммарный отрицательный заряд белковой молекулы уменьшается (рисунок 5).

 

 

методичка по пищевой химии часть 1

 

 

 

 

 

 

 


Наоборот, в щелочной среде подавляется ионизация аминных групп и уменьшается суммарный положительный заряд белка (рисунок 6).

методичка по пищевой химии часть 1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

При определенном значении рН число положительных зарядов на поверхности белковой молекулы будет равным числу отрицательных зарядов, и в целом заряд частицы белка станет равным нулю. Состояние белка, при котором суммарный заряд его равен нулю, называется изоэлектрическим состоянием, рН, при котором белок находится в изоэлектрическом состоянии, называется изоэлектрической точкой и обозначается рI. В изоэлектрическом состоянии за счёт равенства зарядов, силы отталкивания белковых частиц ослабляются, что способствует агрегации белковых молекул и выпадению белка в осадок.

Изоэлектрическая точка белков-анионов обычно проявляется при рН<7, а белков-катионов - при рН >7. Зная значение изоэлектрических точек белков, можно использовать изоэлектрическое осаждение для выделения и фракционирования белков.

При добавлении щелочи или кислоты к белку, выпавшему в осадок в изоэлектрическом состоянии, наступает перезарядка его молекулы и белок вновь растворяется. Таким образом, изоэлектрическое осаждение белков – процесс обратимый.

 

а) Определение изоэлектрической точки казеина

 

Определение изоэлектрической точки белка молока казеина основано на том, что в изоэлектрическом состоянии казеин теряет растворимость и легко осаждается, что проявляется в выраженном помутнении раствора.

 

Ход работы:

 

1. В восьми пробирках, заранее пронумерованными готовят буферные смеси с разными значениями рН (см. табл.2).

2. Содержимое пробирок перемешивают и в каждую вносят по 1 мл раствора казеина.

3. Отмечают пробирку с наибольшей степенью помутнения и находят по таблице 1 рН раствора в этой пробирке. Это значение рН и является изоэлектрической точкой казеина.


Таблица 2 - Состояние компонентов реакционной смеси (мл) для

образования рН при определении изоэлектрической точки

казеина

 

пробирок

Кол-во 0,01н CH3COOH

Кол-во 0,1н CH3COOH

Количество воды, мл

рН

смеси

1

2

3

4

5

1

0,60

-

8,40

5,9

2

1,2

-

7,75

5,6

3

-

0,25

8,75

5,3

4

-

0,50

8,50

5,0

5

-

1,00

8,00

4,7

6

-

2,00

7,00

4,0

7

-

4,00

5,00

4,1

8

-

8,00

1,00

3,8

Выводы:

 

б) Определение изоэлектрической точки желатина

 

Ход работы:

 

1. В 6 пробирок, предварительно пронумерованные помещают соответствующие количества (мл) растворов уксусной кислоты, ацетата натрия, дистиллированной воды и желатина (таблица 3).

2. Содержимое каждой пробирки перемешивают. Затем во все пробирки медленно по стенке, не допуская перемешивания жидкостей, доливают по 2 мл 96%-ного этилового спирта (или ацетона). Через 30 минут определяют изоэлектрическую точку. Она будет соответствовать рН раствора в пробирке с максимальной степенью помутнения в верхнем слое жидкости.

 

Таблица 3 - Состояние компонентов реакционной смеси (мл) для образования рН при определении изоэлектрической точки желатина

 

пробирок

Кол-во воды

Кол-во

0,1н CH3COOH

Кол-во

1н CH3COOH

Кол-во 0,1н CH3COO

Кол-во 3%-ного раствора

желатина, мл

рН

смеси

1

2

3

4

5

6

7

1

3,2

0,8

--

2,0

2,0

5,6

2

3,5

0,5

--

2,0

2,0

5,3

3

3,0

1,0

--

2,0

2,0

5,0

4

2,0

2,0

--

2,0

2,0

4,7

5

--

4,0

--

2,0

2,0

4,4

6

3,2

--

0,8

2,0

2,0

4,1

Выводы

Контрольные вопросы:

 

1. Что такое изоэлектрическое состояние белка?

2. Что такое изоэлектрическая точка белков?

3. Как можно изменить количество положительных и отрицательных зарядов на поверхности белковой молекулы?

 

вставка

 

Белки и аминокислоты, содержащие и карбоксильные и аминные группы, являются амфотерными электролитами, т. е могут диссоциировать и как кислоты и как основания.

В зависимости от реакции растворителя белок будет диссоциировать либо как кислота (в щелочном растворе), либо как щелочь (в кислом растворе). Поэтому в щелочном растворе молекулы белка будут заряжены отрицательно, а  в кислом -  положительно.

В соответствии с этим если мы будем пропускать электрический ток, то в щелочном растворе молекулы белка будут двигаться к аноду, а в кислом – к катоду. Однако, при определённой реакции раствора при определённом рН количество положительных и отрицательных зарядов в молекуле белка будет одинаковое., поэтому белковые молекулы не будут передвигаться в электрическом поле.

Реакция среды, при которой устанавливается равенство положительных и отрицательных  зарядов в молекуле белка, носит название изоэлектрической точки, это одна из характерных констант белков.

В изоэлектрической точке белок обладает наименьшей растворимостью.

К примеру, белок пшеничного зерна – глиадин, наименее  растворим в 60%-ном этиловом спирте при рН 7,3, что практически совпадает с его изоэлектрической точкой (рН 7,1).

При изоэлектрической точке наблюдается также наименьшая вязкость белковых растворов и наиболее лёгкое осаждение белка из раствора.

Если довести раствор белка до изоэлектрической точки, то сам по себе белок все же не выпадает из раствора в виде осадка, что объясняется гидрофильностью белковой глобулы.

Гидрофильность различных групп разная.

 


Лабораторная работа № 3

 

РАСТВОРИМОСТЬ БЕЛКОВ

 

Цель занятия: Изучить растворимость белков, её практическую значимость в пищевых технологических процессах, условия её осуществления (рН среда, присутствие электролитов), а также усвоить общий принцип и необходимые условия формирования белками коллоидного раствора.

Актуальность темы: Важное значение растворимость белков имеет для повышения качества пищевых продуктов, в производстве которых предусмотрен их гидролиз (автолиз – самопроизвольное расщепление) и денатурация (начальные технологические стадии, сушка и хранение).

Потеря растворимости, как правило, сопровождается изменением и других важных функциональных свойств, что в значительной мере отражается на качестве продуктов и степени перевариваемости белка в желудочно-кишечном тракте.

Особые требования к растворимости белков предъявляются при использовании последних в производстве напитков, хлебных, мучных, кондитерских и макаронных изделий.

В напитках применяются белки с высокой растворимостью, а в изделиях из муки – с низкой растворимостью.

Применение белков с чрезмерно высокой растворимостью в составе хлебопекарных улучшителей отрицательно отражается на эластично-вязкоупругих свойствах теста.

Растворимость белков – способность переходить  в жидкую фазу. При этом белки не образуют истинных растворов из-за своей большой молекулярной массы, а формируют коллоидные частицы, т.е. частицы, состоящие из ядра молекулы белка и гидратной оболочки, т.е. слоя заряженных ориентированных молекул растворителя вокруг ядра. Белки различаются по своей растворимости в водных системах (рисунок 7).

Растворимость белка в воде зависит:

1. от характера белка

2. реакции среды

3. присутствия электролитов

1. Чем выше заряд на поверхности молекулы белка, тем сильнее удерживаются частицы растворителя и тем толще оболочка растворителя вокруг ядра. В результате, такая частица устойчиво находится в коллоидном растворе. Формирование гидратной оболочки во многом зависит от величины заряда на поверхности молекулы.

По этому показателю различают 2 вида белка: альбумины – белки с ярко выраженным зарядом молекул (данный заряд позволяет удерживать большие массы слабополяризованных диполей воды, поэтому альбумины хорошо растворяются даже в обычной воде). Наличие дополнительных подвижных ионов ещё более увеличивает растворимость альбуминов.

 


 

методичка по пищевой химии часть 1
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



Белки, имеющие слабовыраженный заряд на поверхности молекул называются глобулинами. Такие белки не в состоянии удерживать диполи воды вокруг себя. Для формирования оболочки им необходимо присутствие в растворе активных, сильно заряженных ионов, т.е. присутствие электролитов. Только в этих условиях они растворимы.

Есть категории белков, имеющих в своём составе высокое содержание гидрофобных водоотталкивающих групп – бензольные и полиуглеводородные группы (вставка 3).

За счёт них такие белки не имеют возможности образовывать вокруг себя оболочки из молекул растворителя и объединяются в пространственные фибриллоподобные структуры (наподобие целлюлозы) и за счёт этого вообще не растворимы. К ним относятся - белки соединительной ткани – коллаген, эластин, кератин и др.

3. Растворимость альбуминов и глобулинов в значительной степени определяется реакцией среды. В кислой среде лучше растворяются белки, обладающие кислыми свойствами (альбумины, глобулины, проламины, глютелины). Щелочные белки (проламины и гистоны) лучше растворяются в щелочной среде.

 

Реактивы и оборудование: Белок яичный неразведённый; пшеничная или соевая мука; кость измельчённая; 5%-ный раствор хлорида натрия; 0,2%-ный раствор едкого натра; реактивы для проведения биуретовой реакции /см. раб.1./; пробирки; пипетки на 1 мл; стеклянные палочки; воронки для фильтрования; бумажные фильтры.

 

Ход работы:

 

1. В одну пробирку вносят 2 капли неразведённого яичного белка и 20 капель дистиллированной воды, содержимое перемешивают и оставляют на 3-5 мин. При этом альбумин растворяется, а яичный глобулин выпадает в виде небольшого осадка. Раствор фильтруют через бумажный складчатый фильтр, предварительно смоченный водой. В фильтрате обнаруживают белок с помощью биуретовой реакции (см. раб №1).

2. В другую пробирку вносят 2 капли яичного белка и 20 капель 5%-ного раствора хлорида натрия. В слабосолевом растворе растворяются и альбумины и глобулины. Белковую природу раствора также определяют биуретовой реакцией.

3. 200 мг пшеничной или соевой муки растирают в фарфоровой ступке с 5 мл 0,2%-ного раствора едкого натра. В раствор переходят альбумины, глобулины и глютелины. Содержимое ступки переносят в пробирку, и после отстаивания верхний мутноватый слой исследуют биуретовой реакцией на содержание белков.

4. В 3 пробирки помещают небольшое количество измельчённой кости, содержащей белок коллаген. В одну из этих пробирок вносят 20 капель воды, в другую - 20 капель 5%-ного раствора хлорида натрия и в третью – 5 мл 0,2%-ного раствора едкого натра. Коллаген не растворяется в воде, солевом растворе и растворе щелочи.

Результаты работы записывают в табл.4, где отмечают растворимость различных белков и делают выводы.

 

Таблица 4 – Растворимость белков

 

Исследуемый

белок

Растворимость

дистиллированная

вода

5%-ный раствор хлорида натрия

0,2%-ный

раствор едкого натра

1

2

3

4

Яичный альбумин

 

 

 

Яичный глобулин

 

 

 

Глютелин муки

 

 

 

Коллаген кости

 

 

 

 

 

Контрольные вопросы:

 

1. Как влияет аминокислотный состав белков на их растворимость?

2. В чём растворимы альбумины, глобулины, глютелины?

3. Назовите белки, нерастворимые в воде, солевых растворах, щелочах.

4.


Лабораторное занятие №4

 

ДЕНАТУРАЦИЯ БЕЛКОВ

 

Актуальность темы:

 

Цель занятия:

 

Белки в растворе присутствуют в виде коллоидных частиц, где белковая молекула является центром этой частицы и несет на своей поверхности заряд (положительный или отрицательный) в зависимости от того каких групп больше.

Вокруг ядра коллоидные частицы, т.е. вокруг белковой молекулы концентрируются в виде диполи воды (диполь – это двухполюсная молекула), один ее конец положительный, а другой отрицательный ведет себя как магнитная стрелка. Диполи воды вокруг белковой молекулы ориентируются одним своим зарядом к молекуле, а другим от нее.

Каким именно зарядом будет повернут диполь молекулы воды к молекуле белка определяется исключительно величиной заряда белковой молекулы (если заряд белковой молекулы отрицательный, то диполь воды повернут к ней своим положительным концом и наоборот.

В зависимости от количества заряда на поверхности белковой молекулы степень его влияния на диполь воды проявляется различным образом и на различных расстояниях от нее. Вблизи ядра электростатические силы максимальны, поэтому молекулы воды здесь образуют наиболее плотный и упорядоченный слой, где каждая молекула повернута головой к ядру, хвостом наружу.

Последующие слои из диполей воды, располагающиеся дальше от ядра коллоидной частицы меньше подвержены силам электростатического притяжения и диполи воды, располагаются в этих слоях менее упорядоченно.

Поскольку все равно молекулы воды даже в удаленных слоях направлены в соответствии с зарядом белкового ядра, противоположно заряжено во внутрь, и аналогично заряжено наружу, то в результате образуется коллоидная частица, состоящая из белкового ядра и водной гидратной оболочки. Толщина оболочки целиком зависит от суммарного заряда на поверхности белка.

Процесс образования гидратной оболочки носит название гидратации.

Такая коллоидная частица имеет на своей поверхности заряд одинаковый по величине и направлению с зарядом белкового ядра. Таким образом, в растворе коллоидная частица представляет собой однополюснозаряженный шарик.

 

На коллоидную частицу белка в растворе действуют силы:

· сила тяжести m-масса к частице; ускорение свободного падения;

· сила электростатического отталкивания между одинаково заряженными макро-частицами (определяется величиной заряда ядра коллоидной частицы);

· Сила теплового движения.

При низких температурах величина третьей силы (сила теплового движения) незначительна, так как основную роль играют первые две силы.

При температуре от 15-40оС сила теплового движения увеличивается, и действие ее направлено на поддержание коллоидной частицы в растворе.

При температуре выше 60 оС сила приобретает первостепенную роль, т.е. коллоидные частицы белка быстро двигаются и ударяются о другие частицы. Их ядра сближаются и всегда происходит денатурация белка, т.е. необратимое осаждение.

Если температурное воздействие на коллоидную структуру было небольшим, то после устранения причины осаждения происходит переход гелевого осадка в золь.

Кроме заряда основной причиной препятствующей самопроизвольному слипанию белковых молекул является гидратная оболочка.

Чем выше заряд ядра коллоидной частицы, тем толще гидратная оболочка и выше заряд на поверхности коллоидной частицы.

Следовательно, больше силы электростатического отталкивания и коллоидная частица более стабильна в растворе и не выпадает в осадок самопроизвольно.

Гидратная оболочка здесь выполняет механическую защитную функцию, отдаляя ядра, друг от друга (рисунок 8).

Для осаждения коллоидных частиц в раствор вводят сильно зарядообразующие элементы (иона Н+, Н-), алифатические спирты кетоны, при этом из-за наличия свежего заряда из гидратной оболочки, удаленные диполи воды перераспределяются и концентрируются вокруг новых зарядообразующих элементов.

В результате толщина гидратной оболочки меньше, ядра сближаются, и происходит их спонтанное слипание с выпадением осадка. Если концентрация зарядообразующих элементов велика в растворе, то эти элементы перетягивают большую долю гидратной оболочки и проникают в ядра, где нарушаются установленные в третичной структуре белка установленные связи или образуются новые.

В результате структура белка частично меняется с четвертичной на третичную, с третичной на вторичную, с вторичной на первичную.

Если затем из системы убрать зарядообразователи, то структура молекулы частично восстанавливается, то есть происходит денатурация.

Таким образом, денатурация – это разрушение связей и перевод структуры белка на более низкую ступень (первичная структура белка).

При реакции, когда белок теряет свою исходную структуру и переходит в первичную, тогда данная денатурация называется полной, а когда до вторичной и до третичной структуры – частичная денатурация.

Особый характер белка каждого вида связан не только с длиной, составом и строением входящих в его молекулу полипептидных цепей, но и систем, как эти цепи ориентируются.

Различают четыре уровня организации белковых молекул (рисунок 8, 9, 10):

методичка по пищевой химии часть 11. Первичная структура белка – последовательность аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Белковая молекула может состоять из одной или нескольких полипептидных цепей, каждая из которых содержит различное число аминокислотных остатков. Разнообразие белков почти безгранично, но не все из них существуют в природе.

2. Вторичная структура белка – способ скручивания полипептидной цепи в пространстве (за счет водородной связи между водородом амидной группы – NH- и карбонильной группы - СО-, которые разделены четырьмя аминокислотными фрагментами).

Вторичной структурой обладает большая часть белков, правда, не всегда на всем протяжении полипептидной цепи (рисунок 9).

Белки обычно коагулируют, или денатурируются. Например, яичный альбумин при нагревании становится белым осадком. Некоторые беки денатурируются под воздействием химических реагентов или радиационного излучения. Белки, имеющие такую относительно простую структуру, известны как фиброзные.

 

3. Третичная структура белка – реальная трехмерная конфигурация закрученной спирали полипептидной цепи в пространстве (спираль, скрученная в спираль). Третичная структура белка обуславливает специфическую биологическую активность белковой молекулы.

В формировании третичной структуры (рисунок 10), кроме водородных связей, большую роль играет ионное и гидрофобное взаимодействие. По характеру «упаковки» белковой молекулы различают глобулярные или шаровидные, фибриллярные или нитевидные белки.

методичка по пищевой химии часть 1Для глобулярных белков более характерна а - спиральная структура, в которой спирали изогнуты, «свернуты». Макромолекула имеет сферическую форму. Они растворяются в воде и солевых растворах с образованием коллоидных систем. Большинство белков животных, растений и микроорганизмов относится к глобулярным белкам.

Для фибриллярных белков более характерна нитевидная структура. Он не растворяются в воде. Фибриллярные белки обычно выполняют структурообразующие функции. Их свойства (прочность, способность растягиваться) зависят от способа упаковки полипептидных цепочек. Примером фибриллярных белков служат белки мускульной ткани (миозин), кератин (роговая ткань).

4. методичка по пищевой химии часть 1Четвертичная структура белка - относится к макромолекулам, а состав, которых входит несколько полипептидных цепей (субъединиц), не связанных между собой ковалентно. Между собой эти субъединицы соединяются водородными ионами, гидрофобными и другими связями. Эта структура обладает всеми свойствами, которые используются в живом организме. Например, гликопротеины известные как мукопротеины содержат молекулы сахара. Молекулы пигмента крови гемоглобина содержит четыре полипептидных цепочки, каждая из которых включает железосодержащую группу гемм (рисунок 11).

Денатурация белков может быть вызвана рядом физических и химических факторов:

· повышением температуры;

· взаимодействием с солями тяжелых металлов;

· концентрированными минеральными кислотами;

· продолжительным воздействием органических растворителей и др.

 

Денатурация чаще всего необратима, но в ряде случаев наблюдается денатурация - восстановление исходной конформации молекулы белка и его природных свойств.

Реакции осаждения белков в зависимости от применяемого осадителя бывают необратимыми и обратимыми.

 

Денатурация белка при нагревании

 

Белки подвергаются денатурации и выпадают в осадок при нагревании их растворов до температуры выше 50-60оС. Свернувшиеся белки не могут быть снова переведены в раствор, так как при нагревании нарушаются связи, стабилизирующие четвертичную, третичную и вторичную структуры белковых молекул, изменяются их физико-химические свойства, в том числе уменьшается их способность к гидратации.

В изоионном состоянии при нагревании увеличивается степень денатурации белков. Так как изоионная точка для большинства белков находится в слабокислой среде, то небольшое подкисление раствора белка способствует более полной его коагуляции при нагревании.


Реактивы и оборудование: 1%-ный раствор СН3СООН; раствор яичного альбумина; пробирки на 10мл.

Ход работы:

 

1. В пять пробирок наливают по 0,5 мл 1% раствора яичного белка. Содержимое первой пробирки нагревают до появления опалесценции (помутнения раствора).

2. К раствору белка во второй пробирке осторожно добавляют 1 каплю 1% раствора уксусной кислоты, нагревают и наблюдают вначале появление опалесценции, а затем выпадение белого хлопьевидного осадка белка (так как раствор подкислен, свертывание белка происходит быстрее). Это объясняется тем, что белок теряет заряд и находится в изоэлектрическом состоянии.

3. К раствору белка в третьей пробирке добавляют 1-2 капли 10% раствора уксусной кислоты и нагревают. Осадок не образуется, так как в кислой среде частицы белка перезаряжаются и приобретают положительный заряд.

4. К раствору белка в четвертой пробирке добавляют 1-2 капли  10% раствора уксусной кислоты, 1 каплю насыщенного раствора хлорида натрия и нагревают. Выпадает осадок вследствие адсорбции ионов электролита (образование двойного электрического слоя) и нейтрализации заряда на частицах белка.

5. К раствору белка в пятой пробирке добавляют 1 каплю 10% раствора гидроксида натрия и нагревают.

Осадок не образуется, так как в щелочной среде отрицательный заряд на частицах белка усиливается.

 

Таблица 5 -

Реактивы

1

пробирка

2

пробирка

3

пробирка

4

пробирка

5

пробирка

1

2

3

4

5

6

1%-ный р-р

яичного

альбумина

0,5 мл

0,5 мл

0,5 мл

0,5 мл

0,5 мл

1%-ный

р-р уксусной

кислоты

1 капля

10%-ный

р-р уксусной

кислоты

1-2 капли

1-2 капли

10%-ный

р-р гидроксида натрия

1 капля

Нагревание

+

+

+

+

+

Отметить свёртывание белка

 

 

 

 

 

2. Результаты опытов по осаждению белков при нагревании оформить в виде таблицы 6.

Таблица 6 – Результаты опытов

 

Номер

пробирки

Среда

Наблюдаемые

изменения

Выводы

1

2

3

4

1

Нейтральная

 

 

2

Слабокислая

(1% СН3СООН)

 

 

3

Кислая (10% СН3СООН)

 

 

4

Кислая (10% СН3СООН + электролит NaCl)

 

 

5

Щелочная (10% NaOH)

 

 

 

 

 

 

 

1. Осаждение белков неорганическими осадителями:

 

а). Осаждение белков солями тяжёлых металлов:

 

При действии небольших концентраций солей тяжелых металлов ( ) на растворы белка происходит денатурация белковых молекул. Осаждение денатурированного белка обусловлено адсорбцией иона тяжелого металла на поверхности белковой молекулы и образованием нерастворимых в воде комплексных соединений.

Кроме того, тяжелые металлы снимают электрический заряд и глубоко изменяют вторичную и третичную структуру макромолекул белка, образуют связи между функциональными группами молекул.

Существуют определенные границы концентраций солей тяжелых металлов, при которых комплекс белка с солью тяжелого металла переходит в осадок, либо находится в растворимом состоянии.

 

Реактивы и оборудование: раствор яичного альбумина; 1% - ный раствор СuSO4; 0,5-ный раствор уксуснокислого свинца; пробирки стеклянные на 10 мл; штатив для пробирок.

Ход работы:

К 2 мл раствора яичного альбумина добавляют 5 капель 1%-го раствора сульфата меди. Выпадает осадок, который растворяется в избытке (7-10 мл) раствора этой соли.

К 2 мл раствора яичного альбумина добавляют 5 капель 0,5%-го раствора уксуснокислого свинца.

Выпадает осадок, который растворяется также в избытке раствора этой соли.

 

Таблица № 7 - Оформление полученных результатов

Реактивы

1 пробирка

2 пробирка

1

2

3

Раствор яичного альбумина

2мл

2 мл

1%-ный раствор сульфата меди

5 капель

0,5%-ный раствор уксуснокислого свинца

5 капель

Отметить образование осадка

 

 

 

 

 

 

б). Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами.

 

Концентрированные минеральные кислоты (Н2SO4, HCI, HNO3 и др.) вызывают необратимое денатурационное изменение белков, следствием чего является агрегация белковых молекул и их осаждение.

Денатурирующее действие минеральных кислот может быть объяснено их воздействием на функциональные группы белка.

Минеральные кислоты, например, превращают отрицательную группу - СОО- в недиссоциированную группу - СООН, что приводит к нарушению ионных связей (солевых мостиков) и, как следствие, к разворачиванию полипептидных цепей.

При длительном воздействии концентрированными минеральными кислотами могут произойти гидролиз белка (разрыв пептидных связей), а также реакции нитрования, окисления, сульфирования, конденсации и др.

 

Реактивы и оборудование: НСЕ конц; раствор яичного альбумина; H2SO4; азотная кислота концентрированная.

 

Ход работы:

К 1 мл концентрированной серной кислоты под тягой, по стенке пробирки добавляют 1 мл раствора яичного альбумина так, чтобы не смешивать жидкости. На границе соприкосновения двух жидкостей образуется белое кольцо выпавшего в осадок белка. При осторожном смешивании жидкостей осадок не исчезает.

В двух других пробирках проводят такие же опыты, но с концентрированной соляной и азотной кислотами.

Оформление полученных результатов отражены в таблице 8.

 


Таблица 8 - Оформление полученных результатов

 

Реактивы

1 пробирка

2 пробирка

3 пробирка

1

2

3

4

H2SO4 (конц).

1 мл

HCE (конц).

1мл

HNO3 (конц).

1мл

Раствор яичного альбумина

1мл

1мл

1мл

Отметить появление осадка на границе раздела фаз

 

 

 

Избыток H2SO4 (конц)

2мл

Избыток HCE (конц).

2мл

Избыток HNO3 (конц).

2мл

Отметить растворение

осадка

 

 

 

 

 

 

 

 

2. Осаждение белков органическими осадителями:

 

а). Осаждение белков органическими кислотами.

Белки из растворов необратимо осаждаются органическими кислотами.

Трихлоруксусная кислота ССI3COOH и сульфосалициловая кислота С6Н3(ОН) (СООН)SО3Н являются очень чувствительными, специфическими реактивами на белок и широко применяются с этой целью.

Осаждение белков трихлоруксусной кислотой часто применяют для полного удаления белков из биологических жидкостей (из сыворотки крови), продукты их распада при этом остаются в растворе.

 

Реактивы и оборудование: 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты; раствор белка; сульфациловая кислота.

 

Ход работы:

 

В пробирку вносят 1 мл раствора белка и добавляют несколько капель 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Выпадает осадок белка.

В другую пробирку вносят 1-2 мл раствора белка и добавляют несколько капель сульфосалициловой кислоты.

Наблюдают выпадение белка в осадок.

Оформление полученных результатов отражены в таблице 9.

 


Таблица 9 - Оформление полученных результатов

Реактивы

1 пробирка

2 пробирка

1

2

3

Раствор яичного белка

1мл

1-2 мл

10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты

2-3 капли

Сульфациловая кислота

–-

2-3 капли

Отметить выпадение осадка

 

 

 

 

 

 

б). Осаждение белков органическими растворителями.

 

Добавление смешивающихся с водой нейтральных органических растворителей (этанола, ацетона, хлороформа) уменьшает растворимость большинства белков в воде и вызывает выпадение их в осадок.

Органические растворители снижают диэлектрическую постоянную белковых растворов, вследствие чего усиливается притяжение между белковыми частицами, способствующее агрегации белков и снижению их растворимости. Кроме того, органические растворители нарушают гидрофобные взаимодействия внутри белковой молекулы. Кратковременное воздействие на белки органическими растворителями при низких температурах вызывает их обратимое осаждение.

Однако, длительное воздействие высоких концентраций органических растворителей при относительно высоких температурах (+20оС и выше) приводит к денатурации белков, необратимому осаждению.

 

Реактивы и оборудование: раствор яичного альбумина; 96% этиловый спирт; 80%-ный ацетон, стеклянные пробирки на 5-10 мл; штативы для пробирок.

Ход работы:

 

К 1 мл раствора яичного альбумина добавляют 1,5-2 мл 96%-ного этилового спирта и встряхивают пробирку. Выпадает осадок белка.

К 1 мл раствора яичного альбумина добавляют 1,5-2,0 мл 80%-ного ацетона и встряхивают пробирку. Выпадает осадок белка.

 

Таблица 10 - Оформление полученных результатов

Реактивы

1 пробирка

2 пробирка

1

2

3

Раствор яичного альбумина

1 мл

1 мл

96%-ный этиловый спирт

1,5-2мл

80%-ный раствор ацетона

1,5-2мл

Отметить образование осадка

 

 

 

 

 

в). Осаждение белков специфическими реактивами.

 

Необратимое осаждение белков можно вызвать воздействием на их растворы различными специфическими реактивами: танин и т.д.

Механизм осаждения белков этими реактивами заключается в образовании нерастворимых комплексных соединений с аминными группами белков.

 

Ход работы:

 

В пробирку вносят 1 мл раствора яичного альбумина, добавляют несколько капель 1%-ной уксусной кислоты и 1 мл насыщенного раствора танина.

Выпадает осадок желтовато-серого цвета.

 

г) Осаждение белков реактивами на алкалоиды.

 

В три пробирки наливают по 1 мл 1% раствора белка, по 4-5 капель 1% раствора уксусной кислоты и по 2-3 капли: в первую пробирку - 10% раствора пикриновой кислоты, во вторую - насыщенного раствора танина, в третью - 5% раствора железисто-синеродистого калия.

Наблюдают выпадение осадка.

 

 

 


Контрольные вопросы:

1. Что такое денатурация белка?

2. Является денатурация белка процессом обратимым?

3. Под воздействием каких факторов происходит денатурация белка?

4. Что такое ренатурация белка?

5. Что представляет собой первичная и вторичная структуры белка?

6. Что представляет собой третичная и четвертичная структура белка?

7. Какие структуры белка вы знаете?

8. Что такое полная и частичная денатурация белка?

9. Поясните, как проявляется денатурация белка при нагревании; воздействии органических растворителей и т.д.

 

Вставка

Белки различаются по форме молекулы. По этому признаку белки разделяют на фибриллярные (нитевидные) и глобулярные (шаровидные).

К первой группе принадлежит кератин, содержащийся в волокнах, рогах и копытах животных, фибрион шелка, миозин мускулов, фибриноген крови.

Ко второй относится подавляющее большинство белков, содержащихся в растениях, животных и микроорганизмах.

Глобулярные белки отличаются от фибриллярных тем, что их молекулы (глобулы) по своей форме приближаются к шару или эллипсоиду вращения. Сами глобулярные белки тоже различаются между собой по форме молекулы (глобулы).

Одни из них имеют шарообразную форму, другие – форму сигары, третьи – эллипсоида вращения. Форму белковой молекулы у глобулярных  белков выражают отношением длины большой оси молекулы к малой оси.

Молекулы некоторых глобулярных белков (зеина) по форме напоминают иглы или короткие нити.

Молекулярная масса таких белков очень велика.

 

Обратимое осаждение белков (высаливание)

 

При добавлении к водным растворам белков сульфатов или хлоридов щелочных и щелочно-земельных металлов (Na2SO4, NaCl, MgSOи др.) происходит дегидратация и нейтрализация белковых частиц, при этом белки выпадают в осадок без изменения нативной структуры.

Такой тип осаждения белков называется высаливанием (рисунок 11).

Высаливание - обратимый процесс, и после удаления соли (разбавлением водой, диализом) белок вновь приобретает природные свойства. Поскольку разные белки высаливаются при различных концентрациях солей, этот метод используется для фракционирования белков.

Для разделения белков методом высаливания широко применяется сульфат аммония.

методичка по пищевой химии часть 1

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Лабораторная работа № 5

 

ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКА ИЗ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

 

методичка по пищевой химии часть 1Пищевые продукты содержат комплекс белков. Для их выделения в чистом виде применяют следующие основные операции (рисунок 12).

 

1. Измельчение пищевого продукта, имеющего твёрдую консистенцию (мясо, рыба, сыр, хлеб, крупа, овощи и т.п.) проводят для разрушения клеточных или других структур (волокон, гелей, кристаллов) с целью высвобождения из них белков. Измельчение обычно проводят тщательным растиранием продукта пестиком в фарфоровой чашке либо в гомогенизаторе с небольшим количеством растворителя. Если необходимо, чтобы белок при этом не денатурировал, то измельчение проводят на холоде, при +40С.

2. Белки пищевых продуктов разнообразны по строению и физико-химическим свойствам, в частности по растворимости, поэтому экстракцию белка из измельчённого продукта проводят в соответствующем растворителе в зависимости от вида выделяемого белка. Иногда перед экстракцией продукт очищают от углеводов и липидов. Для извлечения альбуминов измельчённый продукт настаивают в дистиллированной воде; для выделения глобулинов в солевом растворе; для выделения глютелинов – в слабощелочном растворе; для выделения проламинов и гистонов – в спиртовом растворе. Для выделения плохо растворимых белков: коллагена, эластина и др., продукт подвергают кипячению в щелочном или кислотном растворе, но при этом выделяемые белки частично разрушаются. Экстракцию белков обычно проводят 15-30 минут при периодическом помешивании и для более полного извлечения белков, повторяют 2-3 раза.

3. По окончании экстракции смесь продукта с растворителем фильтруют. Фильтрат содержит белок, а осадок, содержащий остатки продукта, либо используют для экстракции других белков, либо выбрасывают.

4. Для осаждения белка из экстракта (либо жидкого пищевого продукта: молока, сока, растительного масла) используют методы обратимого осаждения белков (т.е. при которых не происходит их денатурация): 1). высаливание-

5. изоэлектрическое осаждение; осаждение органическими растворителями (спиртом, ацетоном при низкой температуре и низкой концентрации растворителя), при этом часто в осадок выпадает ряд белков, близких по своим свойствам. Поэтому проводят  дробное осаждение белков, меняя изоточку или концентрацию соли либо органического растворителя. Осаждённый белок отфильтровывается.

6. Для очистки белков от сопутствующих белков и примесей других соединений (липидов, углеводов и др.) применяют разнообразные методы: диализ, гель-хроматографию, электрофорез и др.

7. Очищенный белок во избежание его денатурации и потери свойств сушат при комнатной температуре на воздухе, либо в вакуум-сушильном шкафу. Высушенный простой белок обычно представляет собой кристаллы или порошок белого цвета.

 

а). Выделение белков из куриного яйца:

 

Реактивы и оборудование:7% р-р сернокислого натрия, серная кислота, безводный сернокислый натрий.

 

Ход работы:

 

5 мл белка свежих яиц смешивают с равным объёмом 36,7%-ного раствора сернокислого натрия. Выпавшие в осадок глобулины отфильтровывают, а в фильтрат добавляют разбавленную серную кислоту до рН 4,7 и безводный сернокислый натрий до появления лёгкой опалесценции.

При стоянии раствора в холодильнике образуются кристаллы яичного альбумина, которые оседают на дно.

С полученными белками проводят биуретовую реакцию.

 

б). Выделение белков из мяса:

 

Ход работы:

 

Выделение водорастворимых белков

0,5г мяса растирают в фарфоровой ступке с 10 каплями дистиллированной воды в течение 3-5 мин до получения гомогенной массы. К растертой кашице подливают при перемешивании небольшими порциями /по 5-10 капель/ дистиллированную воду/ всего в количестве 3 мл/.

Водную вытяжку фильтруют через тройной слой марли. В фильтрате содержатся водорастворимые белки мяса: миоальбумины, миоглобин, миоген, глобулин Х.

Остаток мяса сохраняют для получения солевой втяжки, а с фильтратом проделвают биуретовую реакцию; высаливание альбуминов сернокислым аммонием и гваяковую пробу на присутствие миоглобина: к 5 каплям вытяжки добавляют 1-2 капли свежеприготовленного 1%-го спиртового раствора гваяковой смолы и 1-2 капли 3%-го раствора пероксида водорода. Жидкость окрашивается в зеленый или синий цвет. Реакция обусловлена способностью геминовой группы миоглобина катализировать окисление гваяковой смолы пероксидом водорода в озонид гваяковой смолы синего цвета.

 

Выделение солерастворимых белков

Остаток мяса после получения водной вытяжки отмывают от следов водорастворимой белковой фракции путем повторного экстрагирования новыми порциями воды до тех пор, пока промывная жидкость не перестанет давать биуретовую реакцию. Промывные воды выбрасывают.

Отмытый остаток мяса заливают в ступке 3 мл 5%-го раствора хлорида калия и растирают пестиком в течение 5 минут. В раствор переходят солерастворимые белки: миозин, актин, актомиозин. Жидкость отделяют фильтрованием, а остаток мяса сохраняют для получения коллагена.

С небольшими порциями фильтрата проделывают биуретовую реакцию, реакцию высаливания глобулинов и осаждение белка путем разведения десятикратным объемом дистиллированной воды.

 

Выделение водорастворимых белков

Для удаления следов солерастворимой фракции остаток мяса отмывают новыми порциями хлорида калия до получения отрицательной биуретовой реакции. Промывные воды выбрасывают.

Остаток мяса переносят с марлевого фильтра в широкую пробирку для гидролиза с пробкой и трубкой в качестве холодильника, заливают 1 мл дистиллированной воды и кипятят около 30 минут. При нагревании коллаген частично гидролизуется, превращаясь в желатин и переходит в раствор.

Горячий раствор фильтруют и с фильтратом проделывают биуретовую реакцию. Получается сине-фиолетовое окрашивание, характерное для раствора желатина.

 

в). Выделение белков из молока:

 

Реактивы и оборудование: молоко, концентрированная уксусная кислота, раствор сульфата аммония, реактивы для биуретовой реакции, стеклянная палочка, коническая колба на 100мл, пробирка на 5,10 мл, фильтровальная бумага, термометр.

 

Ход работы:

 

Выделение казеина

50 мл сырого молока нагревают до 40-450С и вносят при помешивании несколько капель концентрированной уксусной кислоты. Выпавший осадок казеина отфильтровывают. Фильтрат используют для выделения других белков, а осадок осторожно снимают стеклянной палочкой с фильтра в пробирку и проделывают с ним биуретовую реакцию на белок.

Выделение лактоальбуминов и лактоглобулинов

2-3 мл фильтрата кипятят до появления хлопьев лактоальбумина и лактоглобулина.

К 5 мл фильтрата в другой пробирке добавляют сульфат аммония до полунасыщения. Выпадают хлопья глобулина, которые отфильтровывают.

Лактоальбумин выпадает в осадок в виде  хлопьев при добавлении к 5 мл фильтрата в третьей пробирке сульфата аммония до полного насыщения. Хлопья альбумина также отфильтровывают.

Полученные осадки снимают с фильтра и проделывают с ними биуретовую реакцию.

 

в). Выделение белков из пшеничной муки:

 

Реактивы и оборудование: пшеничная мука, фарфоровая ступка с пестиком, дистиллированная вода, пипетка на 2,3 мл, фильтровальная бумага, реактивы для биуретовой реакции, 10%-ный раствор хлорида натрия, 70%-ный этанол, штативы для пробирок, карандаш по стеклу.

 

Выделение альбуминов:

О,5г пшеничной муки растирают в фарфоровой ступке с 3 мл дистиллированной воды. Через 2-3 мин надосадочную жидкость фильтруют через бумажный плоский фильтр, а осадок муки промывают в ступке 2 мл воды и после 2-3 мин отстаивания промывные воды удаляют. Промытый осадок сохраняют для выделения других фракций белка, а с фильтратом, содержащим альбумин (лейкозин), проделывают биуретовую реакцию и реакцию высаливания альбумина.

 

Выделение глобулинов:

Остаток муки после выделения альбуминов обрабатывают в ступке 3 мл 10%-ного хлорида натрия и после отстаивания фильтруют. С фильтратом, содержащим глобулины, проделывают биуретовую реакцию и реакцию высаливания глобулинов.

 

Выделение проламинов (глиадинов):

0,5 г пшеничной муки растирают в ступке с 3 мл 70%-ного этанола и смесь фильтруют через складчатый фильтр. С фильтратом, содержащим проламины, проделывают биуретовую реакцию и реакцию осаждения при разведении вытяжки водой. Для этого к 10 каплям спиртовой вытяжки добавляют по каплям дистиллированную воду до появления осадка (или мути) проламинов.


Контрольные вопросы:

 

1. Назовите стадии выделения белков из пищевых продуктов?

2. Для чего проводится измельчение продукта перед экстракцией белка?

3. На чём основано экстрагирование белка из продукта?

4. Какой растворитель применяют для экстракции альбуминов, глобулинов, глютелинов, проламинов?

5. В чём особенности извлечения из пищевого продукта труднорастворимых белков: коллагена, эластина и т.д.?

6. Какие методы применяют для осаждения белков из растворов?

7. Поясните, почему нельзя сушить белок при высоких температурах (выше 600С).

 

 


Лабораторная работа № 6

 

РАСТВОРИМОСТЬ ЛИПИДОВ

 

Актуальность темы: Пищевые продукты содержат в своём составе липиды (жиры, масла), которые могут подвергаться различным химическим превращениям в зависимости от технологических процессов, температурных режимов, условий хранения. Наибольшее изменение липидов наблюдаются при производстве различных фаршей, паштетов, паст и т. д, так как при этом увеличивается удельная поверхность соприкосновения липидов с кислородом воздуха.

Липиды (от греч. липос – жир) – низкомолекулярные органические соединения, являющиеся важной составной частью пищевых веществ. В зависимости от возраста, физической нагрузки, климатических условий потребность в них составляет от 70 до 100г в сутки. Значение жиров для нормального функционирования организма определяется не только их высокой энергетической ценностью (при окислении 1 г жира выделяется энергии в два раза больше, чем при окислении 1 г углеводов или белков). Таким образом, именно липиды обеспечивают от одной трети до половины общего количества калорий средней диеты человека. Незаменимыми компонентами пищи липиды делают потребность организма в жирорастворимых витаминах, которые поступают чаще всего в составе жиров, а также в незаменимых высших жирных кислотах, в том числе предшественников таких биологически активных веществ, как простагландины, тромбоксаны и лейкотриены.

Характерным свойством жиров является их хорошая растворимость во многих органических растворителях (ацетон, хлороформ, диэтиловый эфир и др.) и нерастворимость в воде.

При смешивании жиров с водой образуются эмульсии, стойкость, которых, зависит от среды, в которой они образуются. Наличие в воде веществ – эмульгаторов (мыла, желчные кислоты, карбонаты) делает эмульсии более стойкими. Образование эмульсий обусловлено тем, что в поверхностный водный слой, окружающий жировые капли, устремляются поверхностно-активные частицы эмульгаторов, которые обволакивают капли жира и препятствуют их слипанию.

 

Реактивы и оборудование: Растительное масло, дистиллированная вода, этиловый спирт, бензол, хлороформ, 1%-ный раствор карбоната натрия, пробирки, держатели для пробирок, штативы для пробирок, пробки для пробирок, пипетки на 1,2 мл, карандаш по стеклу, полотенце.

 

Ход работы:

 

1. В 4 пробирки помещают по 0,2-0,3 мл растительного масла. Затем в первую пробирку добавляют 5 мл воды, во вторую – 5 мл спирта, в третью – 5 мл бензола, в четвёртую – 5 мл хлороформа. Содержимое всех пробирок энергично встряхивают. В первой пробирке масло и вода быстро разделяются на два слоя, во второй – образуется мутный раствор вследствие недостаточной растворимости масла в спирте, в третьей и четвёртой образуются прозрачные растворы.

2. В 2 пробирки вносят по несколько капель масла. В одну из них добавляют 2 мл воды, а другую – 2 мл раствора карбоната натрия. Содержимое пробирок интенсивно встряхивают и наблюдают образование эмульсии.

Отмечают различия в стойкости эмульсий в двух пробирках.

 

Контрольные вопросы

 

1. Что такое липиды?

2. Каковы основные физико-химические свойства жиров?

3.  Каков механизм образования водно-жировой эмульсии?

4. Какие вещества являются эмульгаторами жира?

 


Лабораторная работа №7

 

СРАВНЕНИЕ СТЕПЕНИ НЕНАСЫЩЕННОСТИ

ЖИРНЫХ КИСЛОТ В РАЗЛИЧНЫХ ЖИРАХ

 

В природе обнаружено более 200 жирных кислот. Однако широкое распространение имеют не более 20 , которым присущ ряд общих свойств и особенностей.

Жирные кислоты, входящие в состав липидов высших растений и животных, - это монокарбоновые кислоты, содержащие линейные углеводородные цепи (обычно С1220) общей формулы СН3 (СН2)nСООН.

Жирные кислоты, входящие в состав жиров, содержат чётное число атомов углерода. Однако в природе, хотя и редко, встречаются также кислоты с нечётным числом углеродных атомов.

В липидах содержатся кислоты как насыщенные, так и с одной или несколькими ненасыщенными (этиленовыми связями). Они всегда разделены одной метиленовой группой.

--СН=СН—СН2—СН=СН—

 

Наряду с наиболее часто встречающимися в составе жиров насыщенными жирными кислотами:

лауриновой (С12) – СН3-(СН2)10—СООН; миристиновой (С14); пальмитиновой; стеариновой; арахиновой; бегеновой; лигноцериновой в их состав входят также и ненасыщенные – олеиновая, линоленовая, линолевая.

Ненасыщенные жирные кислоты участвуют в расщеплении липопротеидов низкой плотности, в частности холестерина, предотвращают агрегацию кровяных тел и образование тромбов, снимают воспалительные процессы и могут способствовать профилактике целого ряда заболеваний. Полиненасыщенные жирные кислоты - предшественники гормоноподобных веществ - простагландинов, препятствующих отложению холестерина в стенках кровеносных сосудов.

Линолевая, линоленовая и другие полиеновые кислоты не синтезируются в организме человека и должны поступать в организм с пищей. В связи с тем, что эти кислоты необходимы для нормальной жизнедеятельности организма, их относят к незаменимым жирным кислотам или чаще комплекс этих кислот объединяют в группу витаминов F.

Липиды нашли широкое применение в медицине и технике, Из них получают основу для лекарственных мазей, мыло, масляные краски, олифу и др.

От длины углеводородных цепей жирных кислот, входящих в состав жира, и от содержания в нём ненасыщенных жирных кислот зависит его точка плавления. Растительные масла жидкие потому, что в них много ненасыщенных жирных кислот.

Пользуясь способностью ненасыщенных органических соединений присоединять галоген по месту двойной связи, можно определить наличие в жире ненасыщенных жирных кислот по количеству йода, потребовавшегося для насыщения жира.

Реактивы и оборудование: Жиры, хлороформ, 0,001н раствор йода в хлороформе, пробирки, пипетки мерные на 5мл, бюретка для титрования, колбы конические на 100мл, стеклянные палочки, фарфоровые чашечки, бюретка мерная на 25 мл.

 

Ход работы

1. Равные навески (0,3-0,5г) различных жиров – растительного масла, сливочного масла, топлёного жира, маргарина и др. растворяют в одинаковых объёмах (3-4мл) хлороформа.

2. Полученные растворы титруют 0,001 н раствором йода в хлороформе до появления розовой окраски. Сравнивают количества раствора йода, необходимого для насыщения различных жиров.

3. Результаты опыта и его объяснение записывают.

 

Контрольные вопросы

1. Назовите полиненасыщенные жирные кислоты.

2. Какие химические процессы происходят при взаимодействии ненасыщенных жирных кислот с галогенами?

3. В каких жирах содержится наибольшее количество ненасыщенных жирных кислот?

4.


Лабораторная работа №8

 

ПОЛУЧЕНИЕ И ГИДРОЛИЗ ЛЕЦИТИНА

 

Лецитин является одним из представителей фосфатидов. Лецитин – это сложный эфир глицерина, двух молекул жирных кислот, фосфорной кислоты и азотистого основания – холина.

В большом количестве лецитин содержится в яичном желтке, молоке, мозге, икре.

Лецитин выделяют из сухого яичного желтка путём экстрагирования его спиртом при нагревании.

Лецитин не растворяется в ацетоне и образует стойкую эмульсию с водой. При гидролизе лецитин расщепляется на составляющие его более простые соединения: глицерин, жирные кислоты, фосфорную кислоту и холин. Холин в свою очередь, гидролизуясь, даёт продукт триметиламин, имеющий запах селёдочного рассола.

Реактивы и оборудование: Яичный желток, 96%-ный этиловый спирт, ацетон, 10%-ный раствор едкого натра, пробирки, пипетки, стеклянные палочки, стакан на 25-50 мл, водяная баня. Воронка, бумажный складчатый фильтр.

 

Ход работы:

 

1. Получение лецитина.

В небольшой химический стакан помещают 1/5-1/6 часть (около 1г) высушенного на воздухе и растёртого яичного желтка и при помешивании стеклянной палочкой вливают 15 мл кипящего спирта. Смесь перемешивают 10 минут. При этом происходит экстрагирование из желтка лецитина и части пигмента. Спиртовая вытяжка окрашивается в жёлтый цвет, а желток значительно обесцвечивается (если значительная часть спирта испарилась, то его следует долить).

После охлаждения смесь фильтруют через складчатый бумажный фильтр в сухую пробирку. Если фильтрат оказывается мутным, то его фильтруют второй раз через тот же фильтр. Прозрачный фильтрат представляет собой спиртовой раствор лецитина.

В другую пробирку наливают 3 мл ацетона и по каплям добавляют часть полученного фильтрата. Наблюдают появление мути, а затем выпадение осадка лецитина, что указывает на нерастворимость лецитина в ацетоне.

В третью пробирку к 2-3 мл фильтрата прибавляют каплями дистиллированную воду. Образуется стойкая эмульсия.

 

2. Гидролиз лецитина.

В пробирку для гидролиза наливают 5-10 капель спиртового раствора лецитина (см.п.1), добавляют 3-5 мл 10%-ного раствора едкого натра и кипятят 5-10 минут. Показателем прошедшего гидролиза лецитина может служить появление запаха селёдочного рассола, свойственного триметиламину, образующемуся при гидролизе холина.

Контрольные вопросы

 

1. Какова химическая природа фосфатидов?

2. Каковы основные физико-химические свойства лецитина?

3. В каких природных объектах содержится лецитин?

4. По каким показателям судят о течении реакции гидролиза лецитина?

 


Лабораторная работа №9

 

ФЕРМЕНТЫ

 

Актуальность темы: многие ферменты используют в пищевой промышленности. В кондитерском производстве применяется инвертаза дрожжей, превращающая сахарозу в глюкозу и фруктозу, предотвращая кристаллизацию сахарозы при высоких концентрациях.

Глюкозоизомераза, иммобилизованная на целлюлозном носителе, применяется для получения глюкозо-фруктозных сиропов с преимущественным содержанием фруктозы. Крупномасштабным производством является получение глюкозы из крахмала с использованием иммобилизованной амилоглюкозидазы в проточных перемешиваемых реакторах.

Для просветления пива используют протеиназы, в частности папаин, иммобилизованный на хитине. В пивоварении для замены солода используют амилазы. Эти ферменты находят своё применение также при производстве патоки и растворимого крахмала. В хлебопечении амилазы на 30% ускоряют процесс созревания теста, улучшают качество хлеба, предотвращая процесс черствления.

При обработке молока ферменты используют в нескольких технологических процессах.

При производстве сыра одной из основных стадий является коагуляция молока, которая осуществляется при помощи ренина.

Вкусовые свойства сыра могут быть улучшены за счёт укорочения цепи углеродных атомов в результате гидролиза под действием липаз микроорганизмов.

Для стабилизации молока его обрабатывают протеиназами. Так обработанное иммобилизованным трипсином молоко меньше подвержено окислению и в течение двух недель не утрачивает своего вкуса.

Целлюлазы используют при приготовлении растворимого кофе, а также при обработке цитрусовых. Кислая липаза применяется в хлебопечении; она катализирует процесс образования моноглицеридов, препятствующих черствлению хлеба.

 


Лабораторная работа №10

 

ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА И СВОЙСТВ

ПОЛИСАХАРИДОВ ПИЩИ

 

Углеводы – важнейший класс природных соединений, имеющих жизненно важное значение для животных, растений и микроорганизмов. Кроме простых сахаров (глюкоза, фруктоза, сахароза и др.) в питании животных и человека существенную роль играют полисахариды – крахмал и клетчатка (целлюлоза).

Вставка от:

Крахмал является важным компонентом пищевых продуктов, исполняя роль загустителя и связывающего агента.

В одних случаях он присутствует в сырье, которое перерабатывается в пищевые продукты (например, хлебобулочные изделия). В других его добавляют для придания продукту тех или иных свойств он используется широко при производстве пудингов, концентратов, супов, киселей, соусов, салатных приправ, начинок, майонеза.

Один из компонентов крахмала – амилаза – используется для пищевых оболочек и покрытий.

Способность крахмала образовать клейстеры делает его ценным компонентом пищевых продуктов. Клейстеризация крахмала, вязкость крахмальных растворов , характеристика крахмальных гелей зависят не только от температуры, но и от вида и количества других присутствующих компонентов. С этим необходимо считаться, поскольку в процессе производства пищевых продуктов крахмал находится в присутствии таких веществ, как сахар, белки, жиры, пищевые кислоты и вода.

до

Крахмал по пищевой ценности наиболее важный для питания человека полисахарид, состоящий из фрагментов альфа-Д-глюкозы. Он состоит из полисахаридов двух типов – амилозы (неразветвлённая цепочка), амилопектина (разветвлённая цепь).

Молекулярная масса амилозы составляет около 50 000, а амилопектина около 300 000.

Ответвления в полиглюкозидной цепи имеются приблизительно через каждые 24-30 глюкозных звеньев.

В растениях крахмал содержится в виде мелких зёрен с оболочкой из амилопектина. Крахмал образует с водой коллоидные растворы и в отличие от моносахаридов он не восстанавливает аммиачный раствор серебра и цитратный раствор окиси меди.

При кислотном и ферментативном гидролизе крахмала он расщепляется через ряд промежуточных соединений и переходит в альфа-Д-глюкозу.

Характерная для крахмала качественная реакция – образование синего комплекса с йодом. Промежуточные продукт гидролиза крахмала (декстрины, мальтоза) не дают этой реакции.

Клетчатка (целлюлоза) – полисахарид, формирующий опорные структуры растений, состоит из фрагментов бета-Д-глюкозы, располагающихся в виде прямой неразветвлённой цепочки. В отличие от крахмала этот полисахарид нерастворим в воде и не поддаётся гидролизу в пищеварительном тракте человека.

Однако, присутствуя в пище растительного происхождения, клетчатка стимулирует работу пищеварительных желёз. Жвачные животные легко усваивают целлюлозу, поскольку бактерии, находящиеся в желудке, продуцируют ферменты, катализирующие гидролиз полисахарида до глюкозы.

Молекулярная масса клетчатки может достигать от 500 000 до 1 000 000. Плёнка из целлюлозы и её эфиров находит широкое применение в пищевой промышленности в качестве оболочек и упаковочных материалов (целлофан и др.).

 

а). Выделение крахмала из клубней картофеля:

 

Ход работы:

 

1.Клубни картофеля растирают и заливают в фарфоровой чашке водой, после чего смесь отжимают через марлю. Обработку повторяют 3 раза. В полученном фильтрате содержится крахмал.

2.Крахмалу дают отстояться. Для удаления белков крахмала заливают 10%-ным хлоридом натрия и дают отстояться 2 часа.

Затем жидкость сливают, а крахмал отмывают от хлорида натрия сначала прокипячённой холодной водой, а затем дистиллированной водой путём взмучивания и последующего отстаивания осадка крахмала до отрицательной реакции на ион хлора в промывных водах с нитратом серебра.

 

б). Гидролиз крахмала:

 

Ход работы:

 

1. В колбочку берут 10 мл 1%-ного крахмального клейстера и добавляют 4 мл 10%-ной серной кислоты. В 6-7 пробирок наливают по 2 мл разбавленного раствора йода. Колбочку нагревают на сетке на небольшом пламени. Через 5 мин после начала кипения отливают 0,5 мл гидролизата в пробирку с раствором йода и охлаждают полученный раствор.

Отмечают окраску раствора. Такое испытание смеси продолжают и далее через промежутки в 5 минут.

Вначале окраска еще будет синей, но затем она изменяется в фиолетовую (амилодекстрины), далее в красную (эритродекстрины), наконец, желтая окраска йода уже не будет изменяться (ахродекстрины). Декстрин в конечном итоге расщепляются до глюкозы (с промежуточным образованием мальтозы).

2. После исчезновения окраски с йодом колбу исследуемой смесью кипятят еще 5 минут, после чего раствор слегка охлаждают и нейтрализуют серную кислоту сухим углекислым кальцием, добавляя его в раствор небольшими порциями при хорошем взбалтывании. При этом образуется осадок сернокислого кальция.

3. Часть фильтрата испытывают с фелинговой жидкостью на моносахариды. Для этого в пробирку к 1 мл фильтрата приливают равный объем фелинговой жидкости, которая представляет собой щелочной раствор комплексного соединения двухвалентной меди с сегнетовой солью.

Смесь нагревают до кипения. Образующийся осадок (красный) закиси меди указывает на прошедший гидролиз, хотя по этой пробе нельзя еще сказать, прошел ли он до глюкозы или частично в фильтрате есть еще и мальтоза.

4. Часть фильтрата, около 10 мл, выпаривают в фарфоровой чашке сначала на сетке, а под конец на водяной бане до образования сиропа, желтоватого и сладкого на вкус (патока), содержащего глюкозу.

 

Общее уравнение гидролиза крахмала представлено в уравнении:

методичка по пищевой химии часть 1

 

 

 

 


Список использованной литературы

 

1. Методические указания к лабораторным занятиям по биохимии /Под ред. В. В. Рудакова. Л., 1986. 54 с.

2. Кучеренко Н. Е., Бабенюк Ю. Д., Васильев А. Н. Биохимия: Практикум. Киев: Высшая школа, 1988. 128 с.

3. Алейникова Т. Л., Рубцова Г. В. Руководство к практическим  занятиям по биохимии. М: Высшая школа, 1988. 239 с.

4. Кретович В.Л. Биохимия растений. М: Высшая школа, 198

5.

 

 

Дополнительная информация

 

Гидрофильность различных групп разная. Так, пептидная связь –СО-NH- связывает одну молекулу воды, карбоксильная группа –СООН – четыре молекулы воды, аминная – одну и т.д.

Те из молекул воды, которые расположены ближе к поверхности белковой глобулы, ориентированы по отношению к ней строго определённым образом. Чем дальше от поверхности глобулы удалены молекулы воды, тем беспорядочнее их расположение в растворе.

Водная оболочка, имеющаяся вокруг белковой глобулы способствует устойчивости белковых растворов и препятствует осаждению белка.

Если отнять у белковых глобул связанные с ними молекулы воды и уменьшить таким образом их гидратацию, то они начнут слипаться, образуя более крупные частицы белка, и в конце концов будут оседать из раствора.

Обезвоживание белковых глобул можно произвести с помощью органических растворителей или же солей.

Так, при насыщении водного раствора белка спиртом или ацетоном белок осаждается. Поскольку молекулы спирта, или ацетона более гидрофильны, чем белковые глобулы, то последние лишаются водной оболочки и слипаются в более крупные частицы, выпадающие из раствора в виде осадка.

После удаления спирта или ацетона белковый осадок в большинстве случаев, может быть снова растворён в воде.

методичка по пищевой химии часть 1 

Наверх страницы

Внимание! Не забудьте ознакомиться с остальными документами данного пользователя!

Соседние файлы в текущем каталоге:

На сайте уже 21970 файлов общим размером 9.9 ГБ.

Наш сайт представляет собой Сервис, где студенты самых различных специальностей могут делиться своей учебой. Для удобства организован онлайн просмотр содержимого самых разных форматов файлов с возможностью их скачивания. У нас можно найти курсовые и лабораторные работы, дипломные работы и диссертации, лекции и шпаргалки, учебники, чертежи, инструкции, пособия и методички - можно найти любые учебные материалы. Наш полезный сервис предназначен прежде всего для помощи студентам в учёбе, ведь разобраться с любым предметом всегда быстрее когда можно посмотреть примеры, ознакомится более углубленно по той или иной теме. Все материалы на сайте представлены для ознакомления и загружены самими пользователями. Учитесь с нами, учитесь на пятерки и становитесь самыми грамотными специалистами своей профессии.

Не нашли нужный документ? Воспользуйтесь поиском по содержимому всех файлов сайта:



Каждый день, проснувшись по утру, заходи на obmendoc.ru

Товарищ, не ленись - делись файлами и новому учись!

Яндекс.Метрика