Скачиваний:   2
Пользователь:   andrey
Добавлен:   05.01.2015
Размер:   16.3 МБ
СКАЧАТЬ

Содержание.

Введение. 2

1. Литературный обзор  4

1.1.        Тканевая инженерия  4

1.2.        Подложки для тканевой инженерии. 6

1.3.        Клетки. 10

1.4.        Факторы роста. 13

1.5.        Материалы для подложек. 15

1.6.        Метод получения монослойных и многослойных пленок использующий капиллярные силы .. 17

1.7.        Метод укладки матриц из коллоидных частиц, использующий электрофоретическое осаждение . 22

2. Экспериментальная часть. 25

2.1         Исходные материалы и методы их очистки  25

2.2         Получение полимерных суспензий  25

2.3         Очистка полимерных суспензий  27

2.4         Определение размера частиц полимерных суспензий  27

2.5         Получение монослойных пленок из полимерных микросфер. 27

2.6         Приборы и оборудование. 30

3. Обсуждение результатов  31

Выводы. 43

Список литературы. 44

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Введение.

Тканевая инженерия – это будущее медицинской науки и одновременно ее настоящее, основа регенеративной медицины. В настоящее время ведутся исследования по созданию большинства органов и систем, часть технологий перешла из области экспериментальных исследований в клиническую практику. Созданы коммерческие биопрепараты для восстановления таких тканей как кожа, кость, хрящ и др. Тысячи людей в мире уже воспользовались этими услугам.

Решение вопроса о том, где, а главное  - как получить достаточное для восстановления органов и тканей количество регенераторного материала с целью последующей трансплантации, может дать быстро развивающаяся наука – биотехнология. Еще в середине прошлого века морфологи и биологи научились получать культуру клеток и длительно поддерживать ее в живом состоянии. Это позволило вплотную подойти к получению биоискусственных тканей и органов.

Тканевая инженерия – раздел биотехнологической науки, позволяющей на основе применения принципов и методов инженерии и биологии создавать биологические заместители тканей и органов для восстановления, поддержания или улучшения их функционирования. Тканевая инженерия следует принципам культивирования и трансплантации клеток на биосовместимом материале с целью создания de novo недостающего или восстановления поврежденного органа или ткани.

Тканевая инженерия как научное направление в медицине возникло после симпозиума, организованного National Science Foundation USA 1987 году.

В качестве клеточного материала для создания искусственных органов применяют культуру клеток, входящую в состав регенерируемой ткани или являющую их предшественниками. Так, например, для получения материала с целью реконструкции фаланги пальца ученые использовали направленную дифференцировку стволовых клеток костного мозга. В тканевой инженерии используют клетки следующих происхождений: аутогенные – собственные клетки пациента, аллогенные – донорские клетки от других людей и ксеногенные – клетки, полученные от животных.

Современные возможности тканевой инженерии достаточно широки и заключаются в восстановлении: костной и хрящевой ткани, мышечной ткани, кожи, сердечно-сосудистой системы, дыхательной системы, пищеварительной системы, печени, мочевыделительной и половой системы, нервной системы [1].

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. Литературный обзор

 

1.1. Тканевая инженерия

 

Почти 30 лет прошло с тех пор как термин «тканевая инженерия» был создан, чтобы обозначить новое понятие, которое фокусируется на регенерации тканей из клеток с помощью факторов роста и биоматериалов. Эта междисциплинарная разработка привлекла большое внимание, как новый лечебный метод, который может преодолеть недостатки, которые имеют  современные искусственные органы и трансплантация органов, которая также стремилась к замене потерянных или сильно поврежденных тканей или органов. Однако, восстановление тканей тканевой инженерией и её широкое применение на пациентах все еще очень ограниченно и включает в себя: кожу, кости, хрящи, капиллярные и периодонтальные ткани. Основы тканевой инженерии включают: источники клеток, подложки для роста и дифференцирования клеток и переносчики факторов роста. Испытания  животных и человека - главная область применений [1].

Когда ткани или органы сильно повреждены или потеряны вследствие рака, врожденной аномалии, или травмы, так что обычное фармацевтическое лечение не может быть применено, искусственные органы и ткани, или трансплантация органов - первый выбор, который восстановит поражённые ткани или органы. Однако, это хирургическое лечение столкнулось с множеством проблем в настоящее время. Искусственные органы были улучшены путём прогресса в биомедицинской инженерии в прошлые десятилетия, но все еще нуждаются в лучшей биологической совместимости и биологической функциональности. Проблемы в современной трансплантации органов включают в себя нехватку донорских органов и отторжения, хотя иммунодепрессивная терапия очень продвинулась в настоящее время.

Отличительная особенность тканевой инженерии состоит в том, что она должна восстановить собственные ткани и органы пациента, которые полностью свободны от биологической совместимости. Вследствие этих преимуществ, тканевую инженерию часто рассматривают как идеальное лечение. Чтобы восстанавливать новые ткани биомедицинская инженерия использует три основных инструмента: клетки, подложки и факторы роста. Они не всегда используются одновременно. Например,  для разработки костной ткани достаточно использовать только костный морфогенетический белок (BMP), в то время как кожа может быть восстановлена пористым листом коллагена на ране без  клеток и фактора роста. В этом случае, фибробласты мигрируют в поры листа и вырабатывают белки и гликоаминогликаны, которые строят кожную ткань из окружающей здоровой кожи.

Цель исследований тканевой инженерии ясна. Она заключается в установлении новой клинической технологии, которая делает возможным лечение болезней, которые слишком трудно было вылечить существующими методами [2].

Создание искусственных органов состоит из нескольких этапов, на каждом из которых исследователи сталкиваются с множеством проблем.

Мой диплом

Рис. 1. Схема методики, тканевой инженерии [3].

 

На первом этапе отбирают собственный или донорский клеточный материал (биопсия), выделяют тканеспецифичные клетки и культивируют их. В состав тканеинженерной конструкции, или графта, кроме культуры клеток входит специальный носитель (матрица). Матрицы могут быть выполнены из различных биосовместимых материалов. Клетки полученной культуры наносятся на матрицу, после чего такая структура переносится в биореактор с питательной средой, где инкубируется в течение определенного времени. Для каждого типа выращиваемого графта подбирают специальные условия культивирования. Например, для создания искусственных артерий используют проточный биореактор, в котором поддерживается постоянный приток питательной среды с переменным давлением, имитирующим пульсацию тока крови. Иногда при создании графта используют технологию префабрикации: конструкцию вначале помещают не на постоянное место, а в область, хорошо снабжаемую кровью, для дозревания и формирования микроциркуляции внутри графта. В качестве клеточного материала для создания искусственных органов применяют культуры клеток, входящих в состав регенерируемой ткани или являющихся их предшественниками. Так, например, при получении графта для реконструкции фаланги пальца были использованы приемы, вызывающие направленную дифференцировку стволовых клеток костного мозга в клетки костной ткани. Если для создания графта применяется собственный клеточный материал пациента, то происходит практически полная интеграция графта со скорейшим восстановлением функции регенерируемого органа. В случае использования графта с донорскими клетками в организме включаются механизмы индукции и стимуляции собственной репаративной активности, и за 1–3 месяца собственные клетки полностью замещают разрушающиеся клетки графта [3].

 

 

1.2. Подложки для тканевой инженерии.

Было бы очень удобно как для пациентов, так и для врачей, если бы поражённые ткани или органы пациентов можно было восстановить простой инъекцией клеток к целевому участку, но такие случаи относительно редки. Большинство тканей больших размеров и органов с характерной трехмерной структурой требовать наличие матрикса при формировании из клеток. Матрикс называют подложкой, шаблоном, или искусственной внеклеточной матрицей (ECM). Главная функция подложки подобна функции естественной ECM, которая помогает быстрой пролиферации и дифференцировке клеток. Кроме того, подложка, помещенная на участке регенерации, предотвратит от вторжения нецелевых клеток в участок действия.

Несколько технических терминов использовались без ясного определения. Включая 'тканевая инженерия', 'регенеративная медицина', 'клеточная терапия' и 'трансплантация клетки'. Для удобства, они классифицируются в зависимости от использования подложки, как изображено на рис. 2. Согласно этому определению, регенеративная медицина включает два понятия, терапия клетки без использования подложки и тканевой инженерии, которая нуждается в подложке, как в поддержке при регенерации ткани.

 

 

Мой диплом

 

Мой дипломБез использования подложки

 

Клеточная

терапия

 

 

 

 

 

Мой дипломРегенеративная

медицина

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Мой дипломС использованием подложки

 

Тканевая инженерия

Рис. 2. Классификация регенеративной медицины, базирующаяся на использовании подложек [4].

 

Чтобы выполнять функции подложки в тканевой инженерии, подложка должна соответствовать множеству требований. Для начала, она должна иметь связанные микропоры, так, чтобы многочисленные клетки могли быть посеяны, мигрировали вовнутрь, число клеток увеличивалось и подложка должна снабжать их достаточным количеством питательных веществ. Микропоры поддерживают формирование сосудов. Это важно для выживания клеток на подложке. Оптимальный размер пор находится в диапазоне между 100 и 500 мкм. Кроме того, подложка должна иметь оптимальную пористость с адекватной площадью поверхности и механической прочностью. Кинетика абсорбции подложки также критична и зависит от ткани, которая будет восстановлена на ней. Если подложка используется для тканевой инженерии скелетной системы, разрушение биоматериала подложки должно быть относительно медленным, поскольку она должна поддерживать механическую прочность, пока регенерация ткани полностью незакончена. Для тканевой инженерии кожи, подложке не требуется оставаться более чем на один месяц. Если подложка остается в течение более длительного времени чем желаемое, то остающийся материал может задержать регенерацию ткани, а не ускорить её. Это показывает, что кинетика абсорбции материала подложки оказывает значительное влияние на достижение успешного лечения при использовании тканевой инженерии.

Поли-α-гидроксикислоты, особенно гликолиды и полимеры производных молочной кислоты, широко использовались как биоматериалы для изготовления подложек [5].

Вообще, полигликолевая кислота (PGA) и её сополимеры, типа сополимера гликолевой и молочной кислот (PLGA), разрушаются слишком быстро, когда используются в качестве подложки, так что их предел прочности уменьшается вдвое в течение двух недель. Напротив, поли-L-молочная кислота (PLLA) разрушается слишком медленно, требуя 3-6 лет для полного всасывания. Вследствие этой необычной способности всасывания PGA и PLLA, лактановые сополимеры, типа лактид-ε-капролактана (PCL) и сополимера (P[LA-CL]), предпочтительно использовались в недавних работах по тканевой инженерии. Иллюстрация 2 представляет относительные скорости всасывания PGA, PLGA, P[LA-CL], PLLA и PCL.

 

Мой диплом

Рис. 3. График скорости абсорбции абсорбирующихся полиэфиров. Полигликолевая кислота (PGA); сополимер гликолевой и молочной кислот (PLGA); лактид-ε-капролактан (PCL); сополимер (P[LA-CL]).

 

Поли-α-гидроксикислоты разлагаются через неферментативный гидролиз, тогда как встречающиеся в природе биоматериалы, включая коллаген и хитин, подвергаются ферментативному гидролизу. Большинство естественно встречающихся полимеров, исключая хитин, гидрофильные и из них получаются изделия с низкой механической прочностью по сравнению с поли-α-гидроксикислотами. Это ведет к ограниченному применению этих биополимеров. Альгинат не содержит никаких гидролизующихся связей, но его часто используются как ресорбирующийся биоматериал. Потому что альгинат, который был сделан водонерастворимыми посредством ионной связи с двухвалентными катионами типа Ca2+, возвращается к растворимому в воде полимеру, в теле, поскольку ионные связи освобождаются через обмен Ca2+ с Na+ в теле. Почти все другие растворимые в воде биополимеры  переводятся в водонерастворимые через ковалентную связь с использованием глутарового альдегида или карбодиимида.

Разнообразные методы применяются для изготовления пористых подложек. Среди них метод сублимационной сушки [6]. Кроме того, в последние годы для изготовления подложек использовались сложные технологии.

 

В дополнение к полимерным положкам, специально для тканевой инженерии кости использовались неорганические подложки. Биоматериалы, используемые для этой цели включают гидроксиапатит и β-трикальций фосфат (TCP). Эти неорганические подложки со связанной структурой пор хрупки, и при смешивании с мягкими полимерами, приводили к жестким гибридным подложкам, так, что они все еще поддерживали высокую биологическую активность. Известны два способа применении конструкции подложка-клетки. В первом случае, помещают конструкцию в биореактор, чтобы создать проектируемую ткань in vitro (в пробирке). В другом случае имплантируют конструкцию в тело, пока новая ткань не восстановится in vivo (в естественных условиях). Первый называют in vitro (или ex vivo) тканевой инженерией, а последний in vivo (или in situ) тканевой инженерией.

In vitro тканевая инженерия может произвести множество проектируемых тканей из единственного источника клеток. Поэтому, большое внимание было уделено in vitro тканевой инженерии, поскольку открывались перспективы создания нового тканево-инженерного бизнеса. Действительно, массовое производство тканей может предлагать изделия, которые будут востребованы медицинскими «центрами» в соответствии с их требованиями [7].

 

1.3. Клетки.

Источник клеток имеет огромное влияние на развитие тканевой инженерии. Базируясь на различии их происхождения, клетки, применяемые в тканевой инженерии могут быть классифицированы на: 1) аутогенные (собственные клетки пациента), аллогенные (клетки другого человека, не пациента) и ксеногенные (животного происхождения). Аутогенные клетки лучше всего применимы в тканевой инженерии, поскольку их активность остается высокой, тогда как аллогенные и ксеногенные клетки - иммуногенные и будут нуждаться в иммунодепрессивной терапии, когда новая ткань образуется из этих чужеродных клеток. После официального объявления докладов, которые показали присутствие свиного эндогенного ретровируса у свиней, частота использования свиней как источника клеток очень сильно уменьшилась. Проблема, связанная с аутогенными клетками – это трудность в сборе достаточного количества клеток, особенно когда пациент в возрасте или сильно болен. Например, чрезвычайно трудно собрать сердечные клетки у пациента, страдающего инфарктом миокарда. Если количество собранных клеток недостаточно для клинического лечения, количество клеток должно быть размножено с помощью клеточной культуры. Эта процедура требует не только стерильности обработки клеток, но также и отнимает много времени. Кроме того, возможно заражение вирусной инфекцией через эмбриональную сыворотку теленка (FCS), которая наиболее часто используется в клеточной культуре. Аллогенные клетки полезны для восстановления кожи, потому что даже восстановленная аллогенная кожная ткань служит лучшим покрытием раны, чем небиологическая. Ксеногенные клетки обычно использовались для того, чтобы восстановить эпидермальную ткань из кератиноцитов, благодаря  высокой активности эпидермального фактора роста, хотя они и имеют риск возникновения вирусной инфекции.

Клетки могут также классифицироваться на основании различия в степени дифференцировки. Недифференцированные клетки - ES и EG клетки, которые способны дифференцироваться во все виды клеток, существующих в теле, и имеют потенциал к неограниченному делению. Это главные причины тому, почему зрелые стволовые клетки привлекли такое большое внимание. Однако, зрелая клетка включает множество проблем, когда используется для лечения пациентов. Если ES клетки получены от оплодотворенных яиц, которые остались не используемыми после лечения бесплодия, ES клетки являются аллогенными пациенту, который получит трансплантацию клеток.

Во взрослом теле, стволовые клетки существуют как клетки, которые могут дифференцироваться в клетки различного происхождения при соответствующих условиях. Кровяная стволовая клетка (HSC) найденная в костном мозге наиболее хорошо изучена, и  обеспечивает организм ацидофильными гранулоцитами, эритоцитами, остеобластами и B и T клетками. Костный мозг содержит также мезенхимальные стволовые клетки (MSC), которые способны к дифференциации в несколько типов клеток соединительной ткани, включая остеоциты, хондроциты, адипоциты, теноциты, миоциты и стромальные клетки костного мозга [8]. С другой стороны, некоторые ткани во взрослом организме содержат клетки предшественники, которые могут делиться и затем дифференцироваться для обеспечения организма органоспецифичными типами клеток. Например, деление кератиноцитов в коже, гепатоциты, отвечающие на повреждения печени, кишечные клетки, которые пополняют клетки эпителия и остеобласты, активно формирующие новую кость и становящиеся остеоцитами. Эти клетки предшественники, оказывается, ограничивают их дифференцирование определенным происхождением. Никакой уникальный маркер не был найден, который положительно идентифицирует человеческие MSC.

Наиболее хорошо изученная стволовая клетка - HSC, которая существует в костном мозге. Стволовая клетка ткани эпидермиса, как думают, присутствует в основной мембране, но еще не была идентифицирована. MSC может быть стволовой клеткой, которая будет изучена наиболее хорошо после HSC. Способность MSC дифференцироваться в различные ткани, включая кости, хрящи, животный жир, кровеносные сосуды, нервы и кожу, привлекла большое внимание тканевой инженерии. Интересно заметить, что костный мозг восстанавливает только ткань, специфичную участку, куда клетки костного мозга были пересажены, хотя костный мозг должен включать различные виды стволовых клеток.

Клетки костного мозга относительно легко собрать и размножить, и если бы они могли превратиться в фактически любой тип клетки, при соблюдении правильного набора условий, они могли бы стать «универсальной стволовой клеткой» [9].

        При объединении знаний о факторах роста, которые ускоряют дифференцирование, и подходящей подложки или переносчика для доставки к специфическому участку ткани, MSC, может оказаться, идеальной клеткой для развития терапевтической регенерации ткани и тканевой инженерии. Ни непредсказуемые, ни нежелательные типы клеток не были обнаружены среди дифференцированных человеческих MSC. Это отличается от всех сообщений, исследующих дифференцирование ES клеток, которые формируют многократные и непредсказуемые типы клеток при их дифференцировке.

Если взрослая стволовая клетка каждой ткани станет легко доступной для исследователей в области тканевой инженерии, как результат больших успехов в цитобиологии и биотехнологии, клиническое применение тканевой инженерии будет значительно ускоренно. Однако, во многих случаях, число собранных стволовых клеток недостаточно для клинического применения. Мы должны размножить собранные клетки до клеточной культуры. Это - проблема, потому что их пролиферативная способность - вообще не высока, и дедифференцирование будет, в конечном счете, иметь место в течение быстрого увеличения стволовых клеток. Когда стволовые клетки выращены на плоскости, размножение клеток происходит при приемлемой скорости, но сопровождается дедифференцированием. Напротив, дедифференцирование не имеет место, когда стволовые клетки культивировались на трехмерных подложках, но скорость размножения клеток уменьшалась до очень низких уровней. Поэтому, попытались, переключить дедифференцированное состояние клеток к их первоначальному состоянию трехмерной культурой, но эффективность переключения оказалась не так высока, как ожидалось. Самый желательный подход состоит в том, чтобы размножить стволовые клетки с высокой скоростью, придерживаясь недифференцированного первоначального состояния.

Фетальная сыворотка коров, которая наиболее часто использовалась для культивации клеток, содержит ксеногенные разновидности клеток, которые могли бы вызвать инфекции [10].Замена FCS синтетическими сыворотками, используя диапазон рекомбинантных факторов роста исследовалась в течение долгого времени, но пролиферативная способность все еще ниже, чем у FCS [1].

 

1.4. Факторы роста.

Существует ряд белков, которые играют ключевую роль в быстром увеличении и дифференцировании клеток. Эти белки эндогенно выделяются в организме непосредственно самими клетками (аутокринные) или с окружающими клетками (паракринные). Эти белки называются факторами роста клетки или просто факторами роста. Преимущество проектируемой кожной ткани по отношению к небиологическим покрытиям раны, даже притом, что проектируемая ткань является аллогенной, состоит в том, что проектируемая ткань способна снабжать факторами роста участок раны, куда помещена проектируемая ткань.

Факторы роста, которые часто применялись в тканевой инженерии, включают костные морфогенетические белки (BMPs), основной фактор роста фибробластов (bFGF или FGF-2), сосудистый эпителиальный фактор роста.

Замечательная способность факторов роста состоит в том, что BMP и один bFGF может вызвать регенерацию костной и сосудистой ткани, соответственно, без помощи подложки или отобранных клеток. Очевидно, добавление этих факторов роста к конструкции подложка-клетки, должно дальше продвинуть регенерацию ткани по сравнению с регенерацией без использования факторов роста.

Наиболее важная проблема при применении факторов роста в тканевой инженерии - как доставить факторы роста к участку действия. Как известно, инъекция факторов роста в раствор – это не эффективное средство, потому что введенные молекулы белка быстро рассеиваются далеко от участка введения. Три метода были предложены для доставки фактора роста. В первом используют плазмиды ДНК, которые включают ген, кодирующий нужный фактор роста. Будучи введенной в клетку, плазмида участвует в синтезе факторов роста. Второй метод использует также генную технологию. Ген, кодирующий фактор роста транслируется определенному типу клеток и обработанные клетки пересаживаются в организм, где нужная ткань должна проектироваться. Фактор роста, кодируемый геном будет синтезироваться в организм, пока ген не потеряет своей активности в клетках.

В третьем методе, белок фактора роста непосредственно включается в носитель. Этот подход наиболее часто изучался для доставки факторов роста в тканевой инженерии. Выбор носителя очень влияет на кинетику выделения факторов роста. Требования для носителя: должен вызвать денатурацию молекул фактора роста в минимальной степени в течение их внедрения, обеспечивать оптимальную кинетику выделения факторов роста, и должен быть биосовместим.

Единичный фактор роста использовался, главным образом, для разработки ткани одной ткани. Очевидно, было бы лучше использовать множество факторов роста. В настоящее время, много усилий было приложено, чтобы восстановить кровоснабжение, используя различные факторы роста для доставки достаточного количества питательных веществ к клеткам, занятым в регенерации ткани. Применение факторов роста в тканевой инженерии будет ускорено, когда факторы роста станут более доступными и менее дорогими.

 

 

1.5. Материалы для подложек.

Для успешного применения биоразлагаемых полимеров в тканевой инженерии необходимо понимать механизмы переноса под действием компрессионного и сдвигового давления, чтобы гарантировать, что физические и механические свойства подложек выдержат необходимые нагрузки. Существуют три типа полимерных материалов, используемых в тканевой инженерии: природные полимеры, синтетические полимеры  и композиты [11, 12]. Многие природные полимеры являются биосовместимыми, особенно гидрогели, а некоторые широко используются в сочетании с другими материалами в качестве композитных подложек. Синтетические полимеры обладают преимуществом над природными материалами, так как их механические свойства более предсказуемые и воспроизводимые. Гидрогели в основном состоят из жидкости, которая набухает так, что полимерная сетка образует двухфазную конструкцию. Хотя гидрогели могут быть синтезированы, они всегда образуются естественным путём. Композитные подложки получаются смешением двух и более материалов, этим достигаются необходимые свойства и характеристики, так как они включают преимущества каждого из материалов.

Синтетические полимеры – это полимеры полученные человеком, что обуславливает их преимущество над природными полимерами при их использовании: они более эластичные, более предсказуемы при получении, способны перерабатываться в любые формы при любых размерах. Физические и химические свойства могут быть легко изменены, их механические свойства и характеристики разложения могут варьироваться при изменении химического состава их макромолекул. Функциональные группы и боковые цепи могут соединяться, то есть синтетические полимеры способны образовывать поперечно сшитые связи между собой и с белками или другими биологически активными молекулами, присутствие которых в подложке может быть необходимым. Синтетические полимеры разлагаются простым гидролизом, что является благоприятным, так как скорость разложения в этом случае не будет зависеть от кислотности среды и меняться у различных пациентов. Количество известных полимеров, пригодных для использования в тканевой инженерии, огромное. Исследуются также другие полимеры для применения их в данной области. Широкий выбор материалов предоставляет исследователям возможность конструирования подложек с наилучшими свойствами.

 

Мой дипломМой диплом

Рис. 4. Химические структуры некоторых простых разлагаемых полимеров, используемых в тканевой инженерии: 1) полигликолевая кислота, 2) полимолочная кислота, 3) полиэтилен оксид, 4) блочный сополимер гликолевой и молочной кислоты, 5) поликапролактам, 6) полиангидрид, 7) полифосфазен, 8) полиэфир, 9) полиимид.

 

 Широко используемыми синтетическими полимерами являются полигликолевая кислота (PGA), полимолочная кислота (PLA) и их сополимеры, а также поликапролактам (PCL) и полиэтиленгликоль (PEG).

 

1.6. Метод получения монослойных и многослойных пленок использующий капиллярные силы [13].

Динамика двумерного упорядочивания микрометрово-размерных полистирольно-латексных сфер на горизонтальном стеклянном субстрате непосредственно наблюдалась посредством оптической микроскопии. Оказывается, что упорядочивание начиналось, когда толщина водного слоя, содержащего частицы становилась приблизительно равной диаметру частиц. Изменением концентрации электролита, заряда частиц, и их объёмной фракции, доказано, что ни электростатическое отталкивание, ни Ван-дар-Ваальсово притяжение между частицами не существенно при формировании двумерных кристаллов. Прямые наблюдения показали главные факторы, управляющие упорядочиванием - капиллярные силы притяжения (из-за менисков, сформированных вокруг частиц) и конвективного транспорта частиц к упорядоченной области. Контроль скорости испарения воды, оказывается, позволяет получать как хорошо-упорядоченные монослои, так и хорошо-упорядоченные области, состоящие из мультислоев (двойные слои, тройные, и т.д.).

Установка, показанная на рис. 5 использовалась в большинстве экспериментов. Капля латексной суспензии (1) с данным объемом и составом помещалась на стеклянную пластину (2). Капля распространяется по поверхности стекла, окруженной тефлоновым кольцом с внутренним диаметром 14 мм (3). Кольцо поджато к стеклу (чтобы избежать утечки жидкости) толстым латунным листом (4) и винтами (5). Система установлена на столике (6) металлографического микроскопа и накрыта стеклянным колпаком (7), который позволяет освещать  систему сверху. Наблюдения выполнялись через низ ячейки в отраженном монохроматическом свете (длина волны λ = 546 нм) или в проходящем полихроматическом свете. Использовались объективы (8) с увеличением от X4 до X100 (последний, имеющий иммерсионный тип).

Мой диплом 

Рис. 5. Схема основной экспериментальной ячейки: (1) латексная суспензия, (2) стеклянная пластина, (3) тефлоновое кольцо, (4) латунная пластина, (5) винты, (6) стол микроскопа, (7) стеклянный колпак, (8) объектив микроскопа.

 

Предлагается двухэтапный механизм формирования упорядоченного множества частиц. В первой стадии появляется "ядро" упорядоченной фазы, когда верхняя поверхность утончающегося водного слоя в жидкой пленке прижимает латексные частицы к границе раздела вода-стекло. Как показано теоретически, когда сферические частицы частично погружены в жидкий слой на горизонтальном твердом субстрате, деформации границы раздела жидкость-газ дают начало сильным и дальнодействующим капиллярным силам [14].

Предположив, что две частицы радиуса R, частично погружены в жидкий слой, толщина которого стремится к постоянному значению l0 на большом расстоянии от этих двух частиц (рис. 6). Форма мениска подчиняется уравнению Лапласа капиллярности и определяется расстоянием L = 2s между частицами, толщина слоя l0, и значение контактного угла α, который характеризует смачиваемость частиц. Водный уровень во внутренней области (между частицами) выше чем во внешней. Следующий наклон линии контакта трех фаз на поверхности частиц дает начало двум капиллярным эффектам, приводящих к взаимодействию: (1) эффект давления, вызванный более высоким гидростатическим давлением в газовой фазе, чем давление в жидкости при z> l0 (особенно во внутренней области), это различие давления двигает частицы друг к другу; (2) эффект силы поверхностного натяжения вследствие того, что наклон (относительно горизонтального) жидкой поверхности, и следовательно x компонента σx поверхностного натяжения, изменяется по линии контакта. Развитие теории показало, что для микрометровых и меньших частиц эффект поверхностного натяжения превышает эффект давления на многие порядки.

 

 

Мой диплом

Рис. 6. Две сферы, частично погруженные в жидкий слой на горизонтальном твердом субстрате. Деформация жидкого мениска приводит к притяжению между частицами.

 

 

Следует отметить, что капиллярные силы между частицами, частично погруженными в жидкий слой на твердом субстрате (мы называем их "иммерсионными капиллярными силами") на много порядков больше чем капиллярные силы между подобным плавающими частицами, приложенными к единственной поверхности, которые иногда называют "флотационными капиллярными силами".

Механизм, описанный выше предлагает, по крайней мере, два пути для контроля над процессом упорядочивания: (1) контроль скорости конвективного потока, изменяя скорость испарения воды; (2) контроль профиля жидкого мениска, окружающего упорядоченное множество, удаляя (вводя) некоторое количество суспензии в течение эксперимента. Оба пути приводят к изменению жидкой толщины слоя и  наклона поверхности на границе между множеством и окружающим мениском.

Чтобы управлять процессом упорядочивания пользовались измененной экспериментальной ячейкой. Изменяя температуру верхнего стеклянного покрытия ячейки мы имеем возможность изменить относительную водную влажность выше слоя суспензии и таким образом ускорять (или замедлять) испарение воды с поверхности слоя. С другой стороны, впрыск (или высасывание) суспензии в (из) ячейки приводит к увеличению (уменьшению) объема суспензии, таким образом изменяя форму жидкого мениска. Как правило, 2-ые множества лучшего качества (большие "монокристаллические" области) были получены, когда скорость 2-ого роста кристалла была ниже. Результат процесса упорядочивания, оказывается, связан также с величиной угла θ характеризующего наклона окружающего жидкого мениска на границе с растущим 2-ым множеством; см. иллюстрацию 11. Так как жидкий слой в ячейке является вогнутым (рис.5), наклон мениска является более близким к внутренней цилиндрической стенке ячейки. Именно поэтому, когда упорядоченный монослой частиц в середине субстрата растет к цилиндрической стенке, угол θ постепенно увеличения. Величина θ может быть оценена в каждый момент из интерференционных полос (иллюстрация 4, верх). Когда θ становится достаточно большим, можно наблюдать формирование упорядоченного двойного слоя, вместо монослоя. Угол θ может изменяться как путем изменения скорости испарения воды, так и путем изменения объема суспензии в ячейке. Например, ускоренное испарение воды и удаление суспензии от мениска приводят к уменьшению θ. Таким образом, они могут подавить формирование двойного слоя и других мультислоев. В обратном случае, под контролируемым увеличением, угла θ (через замедленное испарение или введением суспензии в ячейку) можно ускорить формирование упорядоченных мультислоев различной толщины. Более близкий осмотр мультислоев с более высокоразрешающим объективом (X 100) показывает, что они состоят из хорошо-упорядоченных областей гексагонально упакованных частиц. Более высокое разрешение показывает также, что узкие полосы между этими слоями состоят из многих маленьких областей из частиц с квадратной упаковкой, как показанные на рис. 7. Полная последовательность слоев следующая: lΔ, 2□, 2Δ, 3□, 3Δ..., где число обозначает число слоев и символ означает гексагональную (Δ) или квадратную (□) упаковку частиц.

 

Мой диплом

Рис. 7. Переход между монослоем (яркий, снизу справа), и двойным слоем (темный, верхний слева) упорядоченных частиц. Частицы, упакованные в квадратную решетку могут быть замечены в зоне перехода.

 

 

1.7. Метод укладки матриц из коллоидных частиц, использующий электрофоретическое осаждение [15].

Схема метода укладки матриц из коллоидных частиц приведен на  рис. 8. Тонкая плёнка золота (150 нм толщиной) была приготовлена на 12 мм по диагонали покровных стёклах, загрунтованных слоем титана (10нм толщиной). Покрытые золотом поверхности были немедленно использованы или хранились в этаноле, чтобы предотвратить загрязнение поверхности. Группирование частиц было выполнено в прямоугольной ячейке, посредством введения полидиметилсилоксановой (ПДМС) прокладки (примерно 1,5 мм толщиной) между стеклом, покрытым золотом и стеклом, покрытым оксидом индия олова (ITO), который служит в качестве прозрачного противоэлектрода. Группирование частиц проходило на золотом электроде. Аппарат был ориентирован так, чтобы золотой электрод был на дне. Группирование частиц наблюдалось через покрытое ITO стекло. Микросферы функциализированные стептавидином (2 мкм, либо одноцветный, либо желтовато-зелёный флюоресцент) были промыты и заново суспендированны в дистиллированной воде и помещены между электродами. Присутствие или отсутствие люминофора не влияло на процесс группировки. Частицы подвергались осаждению до наложения электрических полей. Концентрация частиц (0,025-0,21% с.о.) и время осаждения (1мин – 3ч) были установлены для того, чтобы сделать поверхности различных размеров. После осаждения, генератор волн (Agilent 3312A) использовался для краткого наложения переменного (синусоидального) электрического поля (6-8 VPP) через суспензию частиц. Частота электрического поля устанавливалась для того, чтобы либо ускорить, либо предотвратить слипание частиц. Для образования дисперсных построений, высокие частоты (2000-40000 Гц) были использованы для усиления отталкивания между частицами, для образования плотноупакованных конструкций, использовались низкие частоты (500-700 Гц). После того как частицы группировались, они были необратимо лишены подвижности на золотом электроде путём постоянного электрического поля (2,5 В) в течение 60 сек. Неприкреплённые частицы вымывались используя  PBS.

 

 

 

 

Мой диплом    

Рис. 8. Эта схематическая диаграмма показывает процедуру получения множества покрытых белком коллоидных частиц. Суспензии коллоидов в воде введены между покровными стеклами, покрытыми прозрачной плёнкой  ITO (верхний электрод) и золота (нижний электрод). Частицам позволяют осаждаться на золотой электрод. Переменное электрическое поле применено. Высокочастотное поле приводит к силам отталкивания между частицами, которые помогают в их распределении на поверхности, в то время как низкочастотное поле приводит к силам притяжения между частицами, которые заставляют их формировать плотноупакованное множество. Применение постоянного электрического поля к собранным множествам приводит к необратимой фиксации частиц на золоте.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2. Экспериментальная часть.

2.1 Исходные материалы и методы их очистки

Суспензия заряженных полистирольных микросфер в этаноле, с диаметром 6 мкм и массовой концентрацией микросфер (сухой остаток) 10% (по массе). Эмульгатор Азол 222. Использовалась без дополнительной очистки.

Натрия додецилсульфат (SDS) 10% раствор. Использовался без дополнительной очистки.

Спирт этиловый без дополнительной очистки.

Вода дистиллиованая.

Хлороформ (трихлорметан), стабилизированный 0,6-1,0% этанола, ЧДА. Без дополнительной очистки.

 

2.2 Получение полимерных суспензий

В соответствии с назначением полимерные микросферы должны отвечать комплексу требований:

-   частицы должны иметь узкое распределение по размерам, РЧР;

-  должны сохранять устойчивость в процессе синтеза, очистки методом центрифугирования или ультрафильтрации, при замене водной фазы на раствор буфера;

-   полимерные частицы должны сохранять устойчивость при хранении.

Полимерные суспензии методом затравочной полимеризации получали в стеклянном реакторе (рис. 9) объемом 120 мл, снабженным теплообменной рубашкой, двухрядной стеклянной пропеллерной мешалкой и системой для продувки инертного газа (азота или аргона).

Для поддержания необходимой температуры полимеризации, через теплообменную рубашку реактора с помощью термостата прокачивали воду, температуру которой поддерживали на уровне 60 ±  0,5°С.

В реактор загружали затравочную суспензию, в водной фазе которой растворяли водорастворимые компоненты рецепта полимеризации (додецилсульфат натрия), включали перемешивание и продувку инертным газом. Дегазацию проводили в течение 15-20 мин. В мономере (стирол) растворяли жирорастворимые компоненты (ПДС, инициатор – динитрил азоизомасляной кислоты), вводили смесь в реактор и отмечали время начала набухания. Дегазацию вели еще 2-З минуты и перекрывали подачу инертного газа.

Процесс набухания исходной затравочной суспензии стиролом вели при комнатной температуре в течение 24 часов. После этого реактор подключали к термостату, доводили температуру до 60 ±  0,5°С и отмечали время начала полимеризации. Далее через 2 часа после начала самой полимеризации вводили раствор персульфата калия и стиролсульфонат натрия. Полимеризацию вели в течение 24часов.

Мой диплом

Рис.9. Схема реактора

 

2.3 Очистка полимерных суспензий

 

Полимерные суспензии очищали от неизрасходованных компонентов рецепта полимеризации методом осаждения на центрифуге с последующим диспергированием осадка в чистой воде. Время центрифугирования и число оборотов подбирали индивидуально для каждого вида микросфер: 5000 об/мин и 10 минут для полимерных суспензий с небольшим размером частиц и 1000 об/мин и 5-7 минут для суспензий, частицы которых имели большой размер.

После осаждения частиц в поле центробежных сил надосадок осторожно декантировали, затем заливали дистиллированной водой и частицы редиспергировали. Подобный цикл очистки повторяли от 3 до 6 раз. Этим методом удаляли большинство водорастворимых примесей.

 

2.4 Определение размера частиц полимерных суспензий

 

Средние размеры частиц полимерных суспензий определяли методом сканирующей электронной микроскопии на электронном микроскопе S-570 "Hitachi" (Япония). Каплю разбавленной полимерной суспензии наносили на  предметный столик микроскопа,  который предварительно подвергали гидрофилизации для равномерного распределения суспензии  по  поверхности. Столик помещали  в вакуумную камеру диодного спуттера Eiko IB-3 (Япония),  где при силе ионного тока -  6 мА, напряжении на  электродах - 900 В и вакууме 0.05 Тор образец напыляли золотом и изучали с помощью электронного микроскопа.

 

 

 

 

2.5 Получение монослойных пленок из полимерных микросфер.

 

В настоящей работе была сделана попытка получить монослойные пленки методом, использующим капиллярные силы (описана в п. 1.6, выше).

Метод заключается в образовании гексагонального рисунка из плотно упакованного монослоя микросфер на субстрате за счет испарения дисперсионной среды.

Упорядочивание частиц происходит за счет капиллярных сил при наличии как вогнутого, так и выпуклого мениска.

Была сделана экспериментальная ячейка, в которой, как предполагалось,  капля суспензии должна была образовывать вогнутый мениск. Для изготовления такой ячейки сначала был измерен диаметр 20 мкл капли суспензии, на который она растекается на покровном стекле, для 1%-ой (по массе) водной суспензии он составлял 8 мм. Затем на поверхность покровного стекла был наклеен 2-х сторонний скотч, с отверстием 8 мм, толщина окружающей стенки из скотча составляла 380 мкм.

Микросферы были переведены в воду. Сначала отобрали 200 мкл спиртовой суспензии. Осадили их в центрифуге при 4000 мин-1 в течение 5 минут, затем слой спирта был отобран микропипеткой и добавлено 200 мкл дистиллированной воды. Полученную таким образом водную суспензию озвучивали ультразвуком на аппарате Fisher Sonic Dismembrator 300 частотой 50000Гц в течение 3 минут. Для того чтобы разбить агрегаты микросфер и окончательно отмыть их от спирта. Далее суспензию снова осаждали на центрифуге при таких же условиях, что и для спирта, отбирали жидкость над осадком микропипеткой и добавляли 200 мкл воды.

Для определения концентрации сухого остатка в полученной водной суспензии пользовались весами. Сначала взвешивали фольгу, капали на неё 20 мкл суспензии, записывали значение массы и дожидались полного испарения растворителя. Концентрацию сухого остатка рассчитывали по формуле:

Мой диплом

Далее рассчитали концентрацию водной суспензии в 20  так, чтобы при испарении воды был получен плотный монослой. Расчет проводился следующим образом:

1) Сначала рассчитывали количество частиц, необходимое для полного заполнения окружности радиусом 8 мм:

Мой диплом,

где: S – площадь окружности, занимаемая каплей, Sчаст – площадь поперечного сечения микросферы диаметром 6 мкм.

Мой диплом и Мой диплом,

где: rкапли и rм.с. – радиусы капли и микросферы соответственно, см.

2)  Далее рассчитывали объем занимаемый одной микросферой по формуле:

Мой диплом, см3

3) Затем, зная объем занимаемый одной частицей и количество частиц рассчитали объем занимаемый микросферами в суспензии:

Мой диплом

4) И, наконец, зная плотность полистирола и объем частиц в суспензии, определяем массу сухого остатка:

Мой диплом,

где: ρ – плотность полистирола 1,1 г/см3

И, соответственно сухой остаток в % (по массе):

Мой диплом

Полученное значение сухого остатка в суспензии 6 мкм микросфер, при объеме капли 20 мкл, составило 1,1%.Мой диплом

Поэтому, руководствуясь этими соображениями, разбавляли полученную водную суспензию да концентрации 1%.

Проводились эксперименты с добавлением 3,4·10-5 моль/л додецилсульфата натрия, для того чтобы частицы в суспензии не создавали агрегатов. С окружающим кольцом при температурах 4, 24 и 44ºС.

 Затем было решено увеличить высоту окружающих каплю стенок, предполагая, что тем самым мы сделаем мениск более вогнутым.

Так же были проведены исследования испарения водной суспензии с различных поверхностей: покровное стекло, напыленный на покровное стекло металл (более гидрофильная поверхность) и с нанесенной на покровное стекло полиэтиленовой пленкой (более гидрофобная поверхность), как с окружающим кольцом, так и без него для 4, 24 и 90ºС.

Далее было предложено перевести микросферы из спирта в хлороформ, имитируя тем самым, высокую скорость испарения, и, так как плотность хлороформа больше плотности воды и плотности полистирола, а именно ρCHCl3 = 1,474 г/см3, предотвратить оседание микросфер на покровное стекло до полного испарения.

И так же было предложено перевести частицы в смесь хлороформа и этанола, приготовленную таким образом, чтобы удельный вес смеси был чуть больше удельного веса полистирола, для того чтобы частицы оставались в капле взвешенными во время испарения растворителя, а не всплывали на поверхность, как при использовании хлороформа.

Смесь была рассчитана следующим путем:

Мой диплом,

где:  X – процентное содержание компонента в смеси, в долях от единицы (по объему).

Рассчитанное соотношение составило:

Мой диплом

Суспензия переводилась в эту смесь, так же как и в воду (см. выше).

 

2.6 Приборы и оборудование.

 

Для микроскопических наблюдений использовался оптический микроскоп ЛОМО Biolam с объективами Motic x10 и ЛОМО x20, дополненный камерой Webbers Myscope 130M, в комплекте с программой для захвата изображений ScopePhoto ver. 3.012.146.

Для осаждения микросфер использовалась центрифуга …..

Частицы озвучивали на приборе Fisher Sonic Dismembrator 300.

В экспериментах с нагреванием до 90ºС использовался нагревательный столик фирмы…….

Для напыления металла на покровные стекла диодный спуттер Eiko IB-3 (Япония).

Во всех экспериментах использовались покровные стекла фирмы Menzel-Glaser, без дополнительной очистки.

3. Обсуждение результатов

В первой серии экспериментов 1% водную суспензию полистирольных микросфер с добавлением додецилсульфата натрия (SDS), на покровном стекле с окружающим кольцом, испаряли при разных температурах. Результаты представлены в таблице 1. Все фотографии сделаны с объективом х10.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 1.

t,ºC

Периферия капли

Центр капли

4

Мой диплом

Мой диплом

24

Мой диплом

Мой диплом

44

Мой диплом

Мой диплом

 

 

 

Во второй серии экспериментов так же была использована 1% водная суспензия полистирольных микросфер в воде, нанесенная на покровные стекла с окружающим кольцом и без него. Образцы испарялись при температурах 4 и 90ºС. Результаты сведены в таблице 2.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 2

Субстрат,

tºC

С окружающим кольцом

Без окружающего кольца

Стекло,

4ºС

Центр х10

 

Мой диплом

Периферия х10

Мой диплом

 

 

Центр х10

 

Мой диплом

 

Периферия х10

Мой диплом

 

Стекло,

90ºС

Центр х10

Мой диплом

Центр х10

Мой диплом

 

 

 

Таблица 2(продолжение)

Стекло,

90ºС

Периферия х10

Мой диплом

Периферия х10

Мой диплом

 

Периферия х20

Мой диплом

Металл,

4ºС

Центр х10

Мой диплом

 

 

Центр х10

Мой диплом

 

 

 

 

Таблица 2(продолжение)

Металл,

4ºС

Периферия х10

Мой диплом

Периферия х10

Мой диплом

Металл,

90ºС

Центр х10

Мой диплом

 

Периферия х10

Мой диплом

 

Центр х10

Мой диплом

 

Периферия х10

Мой диплом

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 2(продолжение)

Металл,

90ºС

 

Периферия х10(2)

Мой диплом

 

Периферия х20

Мой диплом

Пленка,

4ºС

Центр х10

Мой диплом

 

Центр х10

Мой диплом

 

 

 

 

 

Таблица 2(продолжение)

Пленка,

4ºС

Периферия х10

Мой диплом

Центр х20

Мой диплом

 

Периферия х10

Мой диплом

Пленка,

90ºС

Центр х10

Мой диплом

Центр х10

Мой диплом

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 2(продолжение)

Пленка,

90ºС

Периферия х10

Мой диплом

Периферия х10

Мой диплом

 

Периферия х20

Мой диплом

 

Проанализируем полученные фотографии.

1. Испарение со стекла

При 4 градусах в образцах, как с кольцом так и без него, частицы распределились практически равномерно.

При 90 градусах, наблюдаемая картинка оказалась интереснее. На образце без окружающего кольца по периферии чётко видно образование 2 окружностей из упакованных шаров, между которыми практически пустое пространство, а центр капли не упакован вовсе.

На образце с кольцом есть упаковка на периферии такого же вида, но не по всему периметру капли, а лишь на небольшом участке.

 

2. Испарение с металла

При 4 градусах никакой упаковки не наблюдалось, все частицы распределены равномерно, как в случае образца с кольцом, так и в случае без него.

При 90 градусах на образце без кольца получили картину, похожую на картину испарения при 90 со стекла, но 1-ая окружность (большая) была более тонкой, а расстояние между 1ой и 2ой окружностями, более большое. На образце с кольцом никакой упаковки не получили.

 

3. Испарение с пленки

При 4 градусах с кольцом упаковка так же не была получена, а в случае образца без кольца, в центре получили упакованные шары, уложенные, правда, в основном в много слоев.

При 90 градусах на образце с кольцом упаковка снова не была получена, а вот на образце без кольца, на периферии по окружности высохшей капли наблюдалась упаковка шаров в монослой.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Третья серия опытов была проведена при смене растворителя на хлороформ и смесь хлороформа и этанола. Так же 1% суспензию в этих растворителях, на покровных стеклах без окружающего кольца, испаряли при 24ºС. Результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3.

Растворитель

Полученная пленка

Хлороформ

Центр х10

Мой диплом

Периферия х10

Мой диплом

Периферия х20

Мой диплом

 

Таблица 3(продолжение)

Смесь хлороформ+

этанол

Центр х10

Мой диплом

 

Периферия х10

Мой диплом

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Выводы.

1. Разработана методика и создана установка для анализа процесса упорядочивания полимерных микросфер на плоских оптически прозрачных подложках.

2. Изучен процесс упаковки полимерных микросфер диаметром 6 мкм в камерах с выпуклым и вогнутым менисками.

3. Исследовано влияние скорости испарения дисперсионной среды на упаковку полимерных микросфер на плоской поверхности.

4. Изучен процесс формирования упаковки полимерных микросфер в камере с выпуклым мениском и в дисперсионной среде, удельный вес которой превышает удельный вес полистирольных микросфер (хлороформ).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Список литературы.

 

1. Y. Ikada. Challenges in tissue engineering. // J. R. Soc. Interface. 2006, 3, 589-601.

2. S.N. Bhatia and C.S. Chen. Tissue engineering at the micro-scale. // Biomedical Microdevices 2:2, 131-144, 1999.

3. Vacanti JP, Langer R. Tissue engineering: the design and fabrication of living replacement devices for surgical reconstruction and transplantation. Lancet 2003; 354(suppl 1): SI32-4.

4. G. Chen, T. Ushida, T. Tateishi. Scaffold Design for Tissue Engineering. // Macromol. Biosci. 2002, 2, №2, 67-77.

5. S. Morita and Y.Ikada. Lactide copolymers for scaffolds in tissue engineering. // NY: Marcel Dekker 111-122, 2002.

6. K. Whang, K.E. Healy. Processing of polymer scaffolds: freeze-drying. // Methods of tissue engineering. San Diego, CA: Academic Press, 697-704, 2002.

7. C.T. Laurencin, H.H. Lu and Y.Khan. Processing of polymer scaffolds: polymer-ceramic composite forms. //  Methods of tissue engineering. San Diego, CA: Academic Press, 705-714, 2002.

8. Kotobuki N. et al. Cultured autologous human cells for hard tissue regeneration: preparation and characterization of mesenchymal stem cells from bone marrow. // Organs 28, 33-39, 2004.

9. Pittenger M. F. Flake A. M. and Deans R. J. Stem cellculture: mesenchymal stem cells from bone marrow. // Methods of tissue engineering 461–469. San Diego, CA: Academic Press, 2002.

10. Louet, S. Reagent safety issues surface for cell/tissue therapies. // Nat. Biotechnol. 22, 253–254, 2004.

11. Nam Y.S., Part T.G. Porous biodegradable polymeric scaffolds prepared by thermally induced phase separation. J Biomed Mater Res 2002:8–17.

12. Zimmermann J, Bittner K, Stark B, Mulhaupt R. Novel hydrogels as supports for in vitro cell growth. Poly(ethyleneglycol) – and gelatinebased (meth) acrylamidopeptide macromonomers. Biomaterials 2002;23:2127–34.

13. N.D. Denkov, O.D. Velev, P.A. Kralchevsky, I.B. Ivanov, J.H. Yoshimura,t and K. Nagayamat.  Mechanism of formation of two-dimensional crystals from latex particles on substrates. Langmuir 1992,8,3183-3190.

14. Kralchevsky, P. A; Paunov, V. N.; Ivanov, I. B.; Nagayama, K.J. Colloid Interface Sci. 1992,151,79.

15. Nathaniel J. Gleason et al. Patterning Proteins and Cells Using Two-Dimensional Arrays of Colloids. Langmuir 2003, 19, 513-518.

Наверх страницы

Внимание! Не забудьте ознакомиться с остальными документами данного пользователя!

Соседние файлы в текущем каталоге:

    На сайте уже 21970 файлов общим размером 9.9 ГБ.

    Наш сайт представляет собой Сервис, где студенты самых различных специальностей могут делиться своей учебой. Для удобства организован онлайн просмотр содержимого самых разных форматов файлов с возможностью их скачивания. У нас можно найти курсовые и лабораторные работы, дипломные работы и диссертации, лекции и шпаргалки, учебники, чертежи, инструкции, пособия и методички - можно найти любые учебные материалы. Наш полезный сервис предназначен прежде всего для помощи студентам в учёбе, ведь разобраться с любым предметом всегда быстрее когда можно посмотреть примеры, ознакомится более углубленно по той или иной теме. Все материалы на сайте представлены для ознакомления и загружены самими пользователями. Учитесь с нами, учитесь на пятерки и становитесь самыми грамотными специалистами своей профессии.

    Не нашли нужный документ? Воспользуйтесь поиском по содержимому всех файлов сайта:



    Каждый день, проснувшись по утру, заходи на obmendoc.ru

    Товарищ, не ленись - делись файлами и новому учись!

    Яндекс.Метрика