Скачиваний:   5337
Пользователь:   andrey
Добавлен:   07.01.2015
Размер:   467.7 КБ
СКАЧАТЬ

Наверх страницы

Содержимое файла:

Явление резистентности, часто определяющее скрининг ЛС, связано с их ак- тивностью. Обоснуйте биологическую активность сульфаниламидов с этих позиций. Проанализируйте указанные факторы и дайте обоснование биологиче- ской активности сульфаниламидов в данном лекарственном средстве (препарате?). Сульфаниламидные препараты являются активными противомикробными средствами. Их действие обусловлено главным образом конкурентным антаго- низмом по отношению к п-аминобензойной кислоте, которая входит в состав фолиевой кислоты и других веществ, являющихся ростовыми факторами для патогенных микроорганизмов. Теория конкурентного антаго- низма подтверждена наличием связи между химическим строением и фар- макологическим действием самих щеплении которого не освобождается , Cl- , СООН- и др.) ведет к полной потере активности. также введение дополнительных радикалов в бензойное ядро снижает актив- ность сульфаниламидных препаратов до полной ее потери. Замещение водоро- да в сульфамидной группе дает соединение с пониженной токсичностью и раз- личной активностью. При получении БАВ растительного происхождения можно использовать в качестве источника резервы дикой природы, плантационные культуры и культуры растительных клеток. Определите возможность биотехнологического процесса получения ЛС. ЛС биотехнологическим способом из культуры растительных клеток по- лучают после выращивания каллусных тканей с использованием специальных методов. Достоинства способа: отсутствие влияния климатических, сезонных и географических фак- торов; сокращение посевных площадей; получение известных веществ (хинин, кодеин и др.), присущих ин- тактному растению и синтез новых веществ не синтезируемых соот- ветствующим целевым растением; использование культур для биотрансформации полученных продуктов; решение проблем дефицита исходного ЛРС, ценных и исчезающих ви- дов, не поддающихся плантационному культивированию; получение фитомассы, полностью свободной от гербицидов, пестици- дов, радионуклидов и тяжелых металлов; возможность управления биосинтезов целевых продуктов за счет ус- ловий культивирования, состава питательной среды и др. способами; возможность индустриализации и удешевление производства некото- рых БАВ, синтез которых пока не разработан или очень дорог. Проанализируйте преимущества биотехнологического производства витаминов на конкретных примерах и определите его основные недостатки. Витамины получали в основном химическими методами, но в связи с ужесто- чением экологических требований к фармацевтическому производству некото- рые витамины получают биосинтезом или сочетанием био- и оргсинтеза. При- менение биосинтеза дает возможность сокращения стадий химического синтеза за счет использования высокоактивных штаммов микроорганизмов. БТ методы нашли применение в синтезе вит. С, убихинона, каротиноидов. аланина и пантотената К с помощью иммобилизованных клеток бактерий Bre- vibacteria. Недостатки – небольшой выход готового продукта, для этого проводят совер- шенствование по направлениям: селекция мутантных штаммов, оптимизация состава и удешевление сред, опти- мизация условий культивирования продуцента. В БТ производстве лекарственных средств, в частности при получении алка- лоидов, довольно часто морфологическая специализация клеток является ос- новной предпосылкой для активного синтеза. Какова связь между количественным выходом алкалоидов и свойствами каллусной культуры клеток? Синтез вторичных метаболитов коррелирует с процессом дифференцировки в культуре клеток. Например в суспензионной культуре Papaver somniferum син- тез алкалоидов начинается только после того, как в ней дифференцируется дос- таточно большое количество специализированных клеток млечников, предна- значенных для депонирования метаболитов. Культуры клеток табака и моркови синтезируют большое количество никотина и антоциана при слабой дифферен- цировке клеток. Синтез вторичных метаболитов в культуре клеток связан с внутриклеточными органеллами – пластидами и эндоплазматическим ретику- лумом. Стабильность синтеза зависит от стадии культивирования и дифферен- цировки клеток. Например дифференцированные корневые каллусы белладон- ны синтезируют тропановые алкалоиды, а недифференциорованные – нет. Используют термин тотипотентность – свойство клеток в полной мере реализо- вывать присущую им генетическую информацию, обеспечивающую их диффе- ренцировку и дальнейшее развитие до целого организма. Для эффективного проведения биотехнологического процесса большое значе- ние имеет питательная среда, в которой микроорганизмы – продуценты БАВ используют в качестве источника азота различные азотсодержащие соединения, содержащие аминный азот или ионы аммония. Какие условия проведения ферментации по источнику азота при получе- нии антибиотиков будут являться оптимальными? Источники азота усиливают рост продуцентов беталактамных, полиеновых ан- тибиотиков (эритромицин, рифамицины), но отрицательно влияют на биосин- тез самих антибиотиков. Интенсивности биосинтеза антибиотиков способствует значительное уменьше- ние в среде источников азота, особенно легкоусвояемых. При этом происходит депрессия ферментов синтеза антибиотиков. Выращивание продуцента на начальных этапах ферментации на обедненных средах нецелесообразно из-за малого накопления биомассы в тропофазе. Возможно ли получение указанного выше лекарственного вещества (хинин) биотехнологическим методом. В чем заключается специфика этого метода. произрастающие в Южной Америке и культивируемые на острове Ява. В Рос- сии не культивируется. Проблему производства хинина можно решить при использовании культуры клеток растения, выращенных методом суспензионного культивирования. Используются ли лекарственные вещества, формулы которых приведены выше (изониазид, фтивазид) при скрининге новых ЛС в качестве объектов позитивно- го контроля. Для позитивного контроля при скрининге новых ЛС лучше использовать изо- ниазид, т.к. он действует на все формы микобактерий туберкулеза, проникает через клеточные мембраны, оказывает терапевтическое действие в кислой среде и более активен, чем фтивазид. В качестве позитивного контроля можно ис- пользовать изониазид для характеристики эффективности антимикробных пре- паратов, сходных по механизму действия с этим веществом. Биотехнологическое производство ЛС основано на использовании биообъектов, функции которых на разных этапах процессов биосинтеза различны. Рассмот- рите варианты их использования. Биообъект – обязательный элемент биотехнологического процесса. Он может существовать как организм (одно и многоклеточный) или изолированные клет- ки, вирусы или мультиферментные комплексы или ферменты (биокатализато- ры) Биообъект осуществляющий полный синтез – продуцент. Индивидуальный фермент или биообъект, выполняющий функцию одной ферментной реакции – биокатализатор. Отсюда - функции биообъекта – полный синтез целевого про- дукта, включающий ряд последовательных ферментативных реакций или ката- лиз лишь одной реакции, которая имеет ключевое значение для получения це- левого продукта. Как можно оценить антибиотическую активность ЛС, поступивших на кон- троль с целью проверки их концентрации? Определение антимикробной активности основано на их способности угнетать рост микроорганизмов. Определение проводят методом диффузии в агар на плотной питательной среде путем сравнения размеров зон угнетения роста тест-микробов, образующихся при испытании растворов ГСО и испытуемого препарата. Известно, что многие ценные лекарственные растения нельзя культивировать в России из-за климатических условий. Предложите возможности решения этой проблемы с помощью биотехнологии. Для растений возможно культивирование растительных клеток или тканей рас- тения на искусственной питательной среде в биореакторах. Использование данных технологий получения биомассы в виде каллусных или суспензионных культур имеет ряд преимуществ: стандартность накапливаемого сырья, высокий выход активного начала, возможность промышленного произ- водства экзотических и малодоступных растений. Метод начинается с процесса получения культуры каллусной ткани, образую- щейся в месте повреждения органов растения. Для успешного культивирования необходимо учитывать влияние физических факторов на рост растения, так и физиологические характеристики на уровне фенотипа и генотипа. Суперпродуцент – это биообъект промышленного использования. Как можно получить его и какими свойствами он должен обладать в отличие от природно- го штамма культуры. Производственные штаммы с высокой продуктивностью крайне нестабильны, так как многочисленные изменения в геноме клеток штамма сами по себе для жизнеспособности клеток положительного значения не имеют. Поэтому му- тантные штаммы требуют постоянного контроля при хранении. Получают суперпродуценты методами мутагенеза, селекции или клеточной инженерии. Для продуцентов антибиотиков у продуцентов повышают резистентность к об- разуемыми ими же веществу. Растительные клетки как источник получения БАВ при культивировании име- ют свои особенности. Как это отражается на условиях ферментационных про- цессов и можно ли их оптимизировать? Оптимизировать БТ процесс можно:  использованием различных биотехнологических режимов;  методами иммобилизации или биотрансформации для повышения выхода целевого продукта (вторичных метаболитов);  аэрацией;  перемешиванием;  подбором ингредиентов питательной среды. При получении антибиотиков в процессе ферментации в питательной среде возможно избыточное или недостаточное содержание указанного вещества (глюкоза). Как в этом случае можно оптимизировать условия ферментации для получения максимального количества целевого продукта? Для каждого штамма продуцента подбирается оптимальный состав среды. Углеродкатаболитная реакция является одним из механизмов, влияющих на синтез вторичных метаболитов. Глюкоза – источник углерода и энергии. Одна- ко быстрый катаболизм глюкозы резко снижает биосинтез антибиотиков. Она ослабляет синтез беталактамов, аминогликозидов и др. Глюкоза сильный ре- прессор. Продукты катаболизма глюкозы подавляют не активность ферментов биосинтеза, а сам синтез ферментов. Для максимального выхода готового про- дукта необходимо оптимальное содержание глюкозы в питательной среде. Приведите сравнительную характеристику каллусных и суспензионных культур при использовании их в качестве субстрата для получения БАВ биотехнологи- ческими методами. Каллусные культуры выращивают на малых площадях на твердых культурах и в дальнейшем используют для синтеза соединений всех классов. Выход про- дуктов более высок, чем при синтезе в самих растениях. Технология каллусных клеток имеет такие преимущества, как надежность и стабильность при выходе биомассы и продуктов вторичного метаболизма, а ат- кже возможностью использования каллусной системы для иммобилизации с последующей биотрансформацимей. Недостаток – применение ручного труда. По сравнению с суспензионными культурами выход продуктов метаболизма выше именно у каллусных систем, но управление процессом культивирования легче при работе с суспензионными культурами. Однако выращивание культур в биореакторах глубинным способом доет полу- чение большой биомассы. Определите роль и значения ферментов растительных клеток с целью получе- ния ЛС. Из ЛРС получают протеазы: бромелин, папаин, фицин, которые используют в заместительной терапии при нарушении пищеварения, в серологической диаг- ностике для выявлении резус-фактора. Из дынного дерева получают папаин, фицин – из латекса растений, бромелин из ананаса. Ими лизируют ткани при гнойно-воспалительных заболеваниях. Часто исполь- зуют и ферменты микробного происхождения. Известно, что в условиях промышленного производства природные продуцен- ты БАВ должны быть генетически модифицированы. Как решается данная про- блема в плане эффективности и безопасности получения ЛС? Безопасность на генетическом уровне означает, что в геном продуцента чуже- родного белка вносится еще одно изменение – удаляются гены, участвующие в синтезе определенной аминокислоты. Поэтому вне среды без этой кислоты микроорганизм не размножается и опасность заражения мала. Эффективность генномодифицированных продуцентов при ферментации и на- работке вторичных метаболитов доказана повышением выхода целевых про- дуктов. В процессе ферментации растительных клеток для увеличения выхода целево- го продукта (например, шиконина) было предложено значительно увеличить какие ошибки были допущены при выборе условий ферментации. Шиконин получают из каллусной ткани культуры клеток воробейника красно- корневого. А из-за низкой интенсивности дыхания необходимость интенсивной аэрации экономически и технически не обоснована, Т.к. каллусные культуры выращивают на твердых средах на малых площадях – использовать реактор большого объема нецелесообразно, также как и интен- сивное перемешивание. Получение субстанции аскорбиновой кислоты является многостадийным про- цессом, в котором сочетаются методы органического и микробиологического синтеза. Какой предшественник аскорбиновой кислоты получают с использованием биотехнологии и каково значение этого этапа для всего процесса в целом? Производство аскорбиновой кислоты – трудоемкий процесс, включающий одну микробиологическую и несколько химических стадий. аскорбиновую кислоту. Erwinica herbicola. При этом D-глюкоза активно превращается в L- аскорбиновую кислоту. бактерий методом глубинной ферментации. Это позволяет сократить стадии химического производства. В производстве пенициллина в начале ферментации было добавлено в пита- тельную среду определенного количество фенилуксусной кислоты, что привело к снижению выхода целевого продукта. Какая ошибка была допущена в данном процессе? Фенилуксусная кислота участвует в процессе образования бензилпенициллинов в результате чего образуются новые связи, замыкающие пептиды с образовани- ем беталактамного кольца, при этом выделяется аминоадипиновая кислота и кофермент А. Внесение фенилуксусной кислоты в начале процесса тормозит протекание взаимосвязанных превращений, т.к. данный агент участвует только в заключи- тельной стадии процесса. Почему в условиях биотехнологических процессов, антибиотик, реагирующий с указанным соединением (но в форме кофермента) предпочтительнее получать методом биосинтеза, а не оргсинтеза? Кофермент имеет в своей структуре альдегидную группу, которая реагирует с соединениями, имеющими свободную аминогруппу, в результате чего образу- ются основания Шиффа. Свободную аминогруппу содержат антибиотики, от- носящиеся к группе стрептомицинов и родственным антибиотикам аминогли- козидов, это стрепто- канна- неомицин, которые получают только методом био- синтеза, продуцент – актиномицеты. Кроме того эти вещества имеют сложное строение, множество изомеров и нестабильны в кислой среде. При производстве витамина РР биотехнологическими методами: какие реко- мендации по оптимальным условиям ферментации продуцента никотиновой кислоты (витамина РР) можно предложить? Никотиновую кислоту получают в виде коферментной формы: никотинамида- денилдинуклеотид (НАД) экстракцией из пекарских дрожжей. Для повышения содержания НАД культивирование проводят в средах с предшественником син- клеток. Для проникновения кофермента через мембраны (сам он не проникает) добавляю ПАВ (цетилсульфат натрия, цетилпиридина хлорид). Это позволяет Почему при многостадийном химическом производстве аскорбиновой кислоты: необходимо применять метод биотрансформации, причем при строго опреде- ленных условиях ее проведения? Условия проведения процесса – аэрация, перемешивание, массообмен, время Может ли утилизация отходов биотехнологического производства ЛС нанести существенный вред экологии? Какова схема утилизации жидких отходов? Жидкие отходы – это культуральная жидкость после отделения от мицелия. Этапы утилизации: грязнений. Осадок отсасывается в трубы, проложенные по дну отстойни- ка. При наличии активного ила образуются углекислый газ и вода. При аэробной очистке добавляют бактериальные закваски: Фенобак для уг- леводородов, Полибак для синтетических детергентов. Учитывая особенности биотехнологического производства: следует ли прово- дить валидацию в соответствии с правилами GMP, если на заводе внедрен но- вый штамм продуцента или произошла незначительная замена в компонентах питательной среды? тальное подтверждение соответствия производственного процесса и качества продукта установленным требованиям. Она обязательна для каждого нового технологического процесса. Повторная (ревалидация) обязательно проводится при любых, в т.ч. частичных изменениях в технологии. Какие условия необходимы для проведения технологического биосинтеза ас- корбиновой кислоты? Какие микроорганизмы осуществляют эту реакцию? Организацию любого биотехнологического производства ЛС предполагает под- готовительный и основной этапы работы. Какие виды работ необходимо про- вести в данном случае. Подготовительные этапы:  подготовка и стерилизация воздуха  герметизация и стерилизация оборудования  стерилизация питательной среды  подготовка посевного материала Основные этапы: биосинтез одно или многоцикличный в зависимости от продуцента и техноло- гии и утилизация отходов. Известно, что в фармацевтическом производстве используются биокатализато- ры. Отличаются ли они от суперпродуцентов, и если да, то в чем состоит отли- чие? Суперпродуцент – биообъект, обладающий различными свойствами в отличие от исходного штамма. Биокатализатор – биообъект, являющийся индивидуальным ферментом, муль- тиферментом или выполняющий функция одной ферментативной реакции. Известно, что из растения Digitalis lanata можно синтезировать как токсичный дигитоксиин, так и менее токсичный дигоксин. Возможно ли преобразование дигитоксина в дигоксин с помощью биотехнологии? Наперстянки синтезируют дигитоксин, обладающий повышенной токсично- стью. При биотрансформации каллусных клеток получают нгедифференцированную суспензионную культуру. Иммобилизированые клетки культуры с постоянной скоростью долгое время трансформируют -метилдигитоксин в - ментом клеток. Существует понятие классического скрининга антимикробных средств и тар- гетного скрининга. В чем заключаются отличия? Классический скрининг – отбор культур микроорганизмов, выявление спектра действия и активности в опытах ин виво и определение токсичности для макро- организма, отдельных органов и тканей. Таргет – мишень. Таргетный скрининг – поиск внутриклеточной мишени, т.е. углубленное изучение механизма действия антимикробного агента на субкле- точном уровне. Выделяют ген, кодирующий образование макромолекул входя- щих в мокромолекулы комплекса. При получении генноинженерного инсулина: какие микроорганизмы исполь- зуются в качестве продуцентов? Почему ферментационные среды должны со- держать лактозу и галактозу? Получают генноинженерный инсулин в культуре E. coli. Галактоза и лактоза – индукторы синтеза бетагалактозидазы. Если не расще- пить глюкозу – она будет использоваться как источник энергии и схема форми- рования цепей А и Б будет нарушена. ном. Использую задачи скрининга сравните вышеприведенную структуру ЛС с пе- нициллином: по спектру биологической активностью. По механизму его взаи- модействия с клеткой. Беталактамные антибиотики подавляют катализируемое ферментами замыка- ние пептидных цепочек в пептидные мостики. Гликановые нити остаются разъ- единенными, формирование непрерывной сети пептогликана, охватывающей клетку не происходит. Пептогликан теряет свои свойства, жизненно необходи- мые бактериальной клетке. При делении клеток постоянно требуется синтез пептогликана. Прекращение его синтеза и ферментативный его гидролиз при- водит к нарушению образования бактериальных клеток. В условиях фармацевтического производства. Каким образом процесс сушки может оказать влияние на качество препаратов нормофлоры? Обоснуйте возможные методы сушки и виды сушки и виды сушилок при полу- чении данной группы препаратов. Препараты нормальной микрофлоры – пробиотики – бифидобактерии. Бифидобактерии – лиофилизированные микробные массы живых антагонисти- чески активных штаммов бифидобактерий. Поэтому сухие препараты можно получать только щадящими способами сушки - методом сублимации. Ампулы ги и запаивают с газовой защитой. Можно ли получить вышеуказанное ЛС методом биотехнологии. Проведите сравнения с другими методами получения данного ЛС в соответствии с таким параметром, как рентабельность производства. Левомицетин или Хлорамфеникол выделяют из культуральной жидкости акти- номицета Streptomyces venezuaelae. Относится к производным паранитробензо- Чаще получают синтетическим путем, выделяя на определенных этапах синтеза необходимые изомеры. Наиболее экономичным и доступным источником син- теза является паранитроацетофенон. Проанализируйте возможность успешного сочетания биосинтеза, оргсинтеза и биотрансформации на примере получения беталактамных антибиотиков. Беталактамные антибиотики – пенициллины и цефалоспорины. Предшествен- антибиотики получают оргсинтезом (метициллин и оксациллин) после фермен- тативного гидролиза бензилпенициллина с помощью пенициллиназы с получе- Для получения новых антибиотиков используют трансформацию беталактама- зы, получая структуры с повышенной резистентностью. Они не должны инак- тивировать структуру беталактама. Для решения проблем рентабельности производства, его экологичности, управ- ляемости производственным процессом, повышения качества получаемых ЛС используют иммобилизацию микроорганизмов и растительных клеток. Укажите преимущества этого метода на примере получения гормональных препаратов стероидной структуры. При получении стероидов ферменты – дегидрогеназы – представлены лабиль- ными белками. Их выделение трудоемко и дорого. Иммобилизованные фермен- ты более стабильны. Также иммобилизация решает проблемы связанные с не- растворимостью стероидных субстратов. Кроме того иммобилизация дает воз- можность многократного использования иммобил. клеток – соответственно уменьшение затрат. Известно, что требования экологии часто не совпадают с регламентом фарма- цевтического производства в целом и биотехнологического в частности. Какие виды очистки и для какого рода отходов предусматривает использование активного ила и «штаммов-деструкторов»? В биотехнологии существует метод создания новых антибиотических препара- тов с использованием мутасинтеза. На примере аминогликозидных антибиотиков представьте его возможности. Аминогликозидные антибиотики – стрепто- гента- нео- канамицин, получаемые из актиномицетов. Мутация – изменение первичной структуры ДНК, приводящее к изменению фенотипа биообъекта. Мутагенез – обработка биообъекта химическими реагентами или воздействие физических факторов. Мутагенез применяют для получения биообъектов с ге- нами, препятствующими ферментативным инактивациям. В молекуле канами- чивость и антибиотическая активность. Как можно масштабировать получение аминокислот в условиях биотехнологи- ческого производства? Объясните процессы ретроингибирования, репрессии и их роль в получении конечного продукта. Бактерии синтезируют аминокислоты для собственных нужд. Для регулирова- ния метаболизма используют ретроингибирование – ингибирование активности ферментов собственного синтеза. Репрессия – подавление всего комплекса ферментов соответствующей биосин- тетической цепи. Продуцент Е. coli. На примере треонина: синтез аминокислоты идет поэтапно мент аспартокиназу и выделяют треонин в свободном виде. Во втором случае при накоплении определенной аминокислоты тормозят дей- ствие всего ферментного комплекса и выделяют нужные аминокислоты. В условиях биотехнологического производства какие витамины группы В мо- гут быть получены с использованием микробиологического синтеза? При производстве витаминов: имеет ли коферментные производные указанная выше формула химического соединения, если да, то какие. Выберите способ производства – химический, химико-энзиматический, биоло- гический или микробиологический. ответ обоснуйте. Биосинтез рибофлавина осуществляется растительными, бактериальными клет- ками и плесневыми грибами. Коэнзимные формы: флавиномононуклеотид и флавиноадининнуклеотид. Обнаружено явление сверхсинтеза при промышлен- – нестабильность штамма при хранении. В настоящее время получают с ис- Химическим методоб витамин получают с использованием биокатализаторов – сухих клеток бревибактерий. При получении многих ЛС используются методы генетической инженерии. Что включает в себя понятие рекомбинантная структура и как ее можно полу- чить. Рекомбинантная ДНК – молекула ДНК, полученная объединением ин витро разнородных, в природе не встречающихся фрагментов ДНК. получают клонированием и встраиванием с помощью вектора ген или гластер генов в ДНК. При этом цепочку разрезают рестриктазами и сшивают участки различных цепей ДНК и получают клон – генетически однородное потомство одной клетки. Совершенствование биообъектов как источников ЛС включает несколько на- правлений. Определите эти направления в соответствии с целевыми задачами. Биообъекты совершенствуют: мутагенезом селекцией клеточной инженерией генетической инженерией с целью получения продуцентов, суперпродуцентов или биокатализаторов, об- ладающих повышенным биосинтезом целевого продукта, устойчивостью при хранении и т.п. При промышленном получении рекомбинантных белков выбор микроорганиз- ма-продуцента зависит от многих факторов. Определите критерии отбора мик- роорганизма.  Микроорганизм должен обладать умеренной патогенностью  Способен расти в условиях производства на недифицитных и доступных средах При совершенствовании биотехнологического производства активно использу- ется иммобилизация биообъекта. Какие технологические проблемы производства ЛС решает инженерная энзи- мология. Энзимология – возможность использования ферментов в изолированном виде. Повышение стабильности ферментов и ферментных систем. Предсказуемость результатов. Скрининг – это необходимая составляющая поиска и создания новых ЛС. В чем суть скрининга и как он осуществляется на современном уровне. В биотехнологическом производстве биообъект является главным источником получения БАВ. Определите его свойства с учетом возможности использования его в производстве ЛС. Считается, что морфологическая специализация клеток является предпосылкой для синтеза БАВ. В каких случаях можно получить алкалоиды от Atropa belladonna и Rauwolfia serpentine биотехнологическими методами. Путем получения каллусных клеток и их дифференциации – корневых каллусов указанных растений. Дифференцированные клетки белладонны синтезируют тропановые алкалоиды. Выход алкалоидов раувольфии наблюдается при использовании недифферен- цированных клеток. Получение аминокислот может быть осуществлено химическим, химико- энзиматическим путем, гидролиза белковосодержащих субстратов, а также прямым микробиологическим синтезом. предложите и обоснуйте выбор метода, если этой аминокислотой является ли- зин, глицин и метионин. Лизин получают биосинтезом путем реингибирования активности аспартокина- зы и блокированием синтеза треонина из штамма продуцента коринобактерий. метионин – в основном химическим способом – тонкий органический ситнтез, т.к. D-изомер его малотоксичен. Метионин можно получить биосинтезом в цепочке получения лизина после об- разования гомосерина. На биотехнологическим производстве в цехе ферментации процесс биосинтеза антибиотика рубомицина перешел в стадию окончания процесса. Какие параметры биосинтеза должны быть изменены для того, чтобы продол- жить ферментацию? Антибиотик антрациклинового ряда. Продуцент – актиномицет. Относится к группе межкалантов, внедряющихся между слоями пар оснований ДНК. Осо- бенность производства – двухфазный характер развития продуцентов. сивное накопление биомассы продуцента. На основании классификации биосинтеза по материальным потокам: Проведите сравнительную характеристику режимов ферментаций в зависимо- сти от целевого продукта биотехнологического производства. Центральный процесс биотехнологического производства биосинтез в фермен- тере. Классификация по принципу организации материальных потоков: по типу целевого продукта: совершают полный цикл. В конце культ. жидкость сливают выделяют и очи- щают целевой продукт. клонениях севного материала. Последние достижения в области геномики и протеономики позволяют решать проблемы поиска безопасных и эффективных ЛС. Какое значение имеют гены вирулентости и в чем суть метода IVET. Ген вирулентности – участок ДНК, вызывающий развитие инфекционного про- цесса. IVET – выявление и выделение генов в бесклеточных системах отбора ингиби- торов. Геном с помощью рестриктаз делят на фрагменты, которые включают в пластиды, водят в E. coli и вносят в организм животного. Спустя сутки высева- ют и исследуют. При условии, что нарастание биомассы коррелирует с синтезом вторичных ме- таболитов, выберите оптимальный режим культивирования растительных кле- ток по принципу организации материальных потоков. Зная молекулярные механизмы внутриклеточной регуляции в микробной клет- ке, можно управлять процесса биосинтеза. Каково влияние ретроингибирования на выход получаемой в качестве целевого продукта – аминокислоты лизина? Ретроингибирование – снижение активности аспартакиназы, которое необхо- димо при избыточном накоплении лизина и треонина. Треонин блокирует био- синтез и его убирают проводя мутацию, блокирующую ген и добавляют читый треонин. Для оптимизации процесса биосинтеза пенициллина в питательную среду до- бавляют аминокислоты. Как это может отразиться на количественном выходе целевого продукта, если добавить лизин в значительных концентрациях? При избытке лизина происходит подавление образования альфааминоадипино- вой кислоты по принципу обратной связи, при этом снижается синтез беталак- тамного антибиотика. При получении БАВ рост каллусной ткани в процессе ферментации осуществ- ляется в несколько этапов. В какой фазе необходимо стимулировать активность клеток? В фазе накопления биомассы, т.к. синтез вторичных метаболитов чаще проис- ходит в экспоненциальной фазе, когда ростовые процессы особенно активны, либо в период, когда прирост клеток прекращается. Проблема безопасности биотехнологического производства требует соблюде- ния определенных условий. Какие условия на физической и генетическом уровне гарантируют безопас- ность работы со штаммом при получении ЛС? Инженерная энзимология имеет большой потенциал масштабирования биотех- нологического производства. В этом случае какими свойствами должен обладать промышленный биокатали- затор? Промышленный биокатализатор – иммобилизованный фермент, т.е. связанный с нерастворимым носителем при сохранении функциональности, т.е. каталити- ческой активности методами инженерной энзимологии. Это повышает стабиль- При получении нового противотуберкулезного препарата было установлено практическое отсутствие побочных эффектов и слабая токсичность, но в кли- ническую практику этот препарат не был внедрен. Объясните ситуацию в плане скрининга ЛС. Одна из инфекционных клиник закупила партии пенициллина и стрептомици- на. Через некоторое время в аптеку пришли жалобы на отсутствие терапевтиче- ского эффекта почти у всех больных клиники. После проверки в лаборатории ЦККЛС было установлено, что это стандартные препараты – не фальсификаты. Проанализируйте эту ситуацию с точки зрения генетических аспектов «инфек- ционной резистентности» или «госпитальной инфекции». Применяемые антибиотики с геномом микроорганизма непосредственно не взаимодействуют. Однако в популяциях микроорганизмов происходят спон- танные мутации отдельных генов. Одни и те же антибиотики при постоянном и непрерывном применении играют роль селективных факторов отбора рези- стентности к ним мутантных микроорганизмов – госпитальная инфекция в от- дельном ЛПУ – не поддающаяся лечению ранее применяемыми антибиотика- ми. В процессе биосинтеза антибиотиков большое значение имеет содержание уг- лерода, азота и фосфора в питательной среде. Как влияет изменение содержания этих веществ на процесс биосинтеза вторич- ных метаболитов, и на процесс ферментации в целом. Глюкоза ослабляет биосинтез антибиотиков. Глюкоза, фруктоза и галактоза – сильные репрессоры этого процесса. Лактоза репрессором не является. Высокое содержание фосфора (в виде солей) неблагоприятно для большинства антибиотиков. Обогащение клетки фосфором (АТФ) повышает скорость роста мицелия, а образование LLD-трипептида – ключевое соединение с которого на- фосфатом. Но фосфор не может быть полностью исключен. Азот усиливает рост беталактамных продуцентов, при избытке азота наблюда- ется замедление роста, связанное с уровнем глютаминсинтетазы, но механизм этого до конца не выяснен. Биотрансформация как способ преобразования одного химического соединения в другое с использованием определенных ферментов, определяющих тот или иной химический процесс (реакцию), может быть использован в случае полу- чения менее токсичного карденолида наперстянки шерстистой из дигитоксина. Проанализируйте, каким образом можно использовать в данном случае био- трансформацию? В биотехнологическом процессе производства ЛС большое значение имеет пи- тательная среда. Предложите оптимальную питательную среду в биосинтезе антибиотиков. Для получения тропановых алкалоидов используют каллусные ткани растения Атропа белладонна. Специализированные клетки предполагают дифференци- рованные и дидифференцированные каллусы. Какие каллусы определяют успех биосинтеза тропановых алкалоидов? Производство ферментов имеет определенную специфику их получения с по- мощью биотехнологии. Определите эту специфику в соответствии со свойствами самих ферментов. Все ферменты относятся к глобулярным белкам, каждый фермент выполняет специфическую функцию, увеличивая скорость реакции, поэтому необходимо строго соблюдать рН, состав среды и температуру. Получение ферментов про- водят при тонком измельчении тканей при этом необходимо исключить дена- турацию белка. Для этого вносят защитные добавки: SH-соединения (цистеин, глутатион). Какие требования предъявляют к воде, используемой в биотехнологическом процессе при выращивании посевного материала и проведения микробиологи- ческого синтеза? Проведите сравнение с фармакопейными статьями. Вода должна быть простерилизована. При внедрении технологии суспензионного культивирования: Какие основные свойства растительных клеток необходимо учитывать? Как это связано с выбором режима ферментации и особым устройством фер- ментера? Суспензионное культивирование предполагает использование специальных биореакторов с механическим перемешиванием или аэрацией. тельную среду и одновременно забирают тот же объем клеточной суспензии, т.к. нарастание биомассы четко коррелирует с синтезом вторичных метаболи- тов. Какие этапы работы в биотехнологическом производстве ЛС предполагают подготовительную стадию? В качестве источников многих ценных гормональных препаратов стероидной структуры может служить как сырье растительного происхождения, так и про- дукты его модификации. Выберите наиболее перспективное сырье и проведите сравнительную характе- ристику. Инсулин – E. coli (синтезирует обе цепочки человеческого инсулина, особенно штамм соматотропного гормона. Эритропоэтин – только в культуре клеток млекопитающих. На современном лекарственном рынке широко представлены такие антибиоти- ки как стрептомицин, неамицин, гентамицин, амикацин. Определите путь биосинтеза этих антибиотиков. Определите промышленный штамм по генотипическим и фенотипическим при- знакам. Синтезируются актиномицетами. Предшественник – глюкоза. Генотип – генетическая конструкция организма. Набор всех его аллелей (одна Фенотип – совокупность всех признаков особи, формирующаяся в процессе взаимодействия ее генотипа и внешней среды. Укажите требования к продуцентам при производстве пробиотиков (нормофло- ров). Продуценты – бифидо и молочные бактерии  д.б. безвредны  штаммы симбиота выделяют из кишечного содержимого только здоровых людей  проявлять эффективную антагонистическую активность  должны продуцировать пероксиды и антибиотические вещества  непатогенны  технологичны и хорошо размножаться скому способу его получения, когда в качестве продуцента данного витамина используются пропионовые бактерии, выращиваемые на богатой среде в опре- Предложите оптимальный метод ферментации и условий ее проведения. Объ- ферментации. зола и макроциклической корриновой системы. Синтезируется пропионовыми бактериями, предшественником синтеза является дающий терапевтической активностью. При получении штаммов суперпродуцентов аминокислот, например, треонина или лизина, используют только определенные микроорганизмы. Подберите соответствующий микроорганизм для получения штамма суперпро- дуцента лизина и выберите путь его биосинтеза. Иммуноферментные методы успешно применяют пи мониторинге ЛС. В чем сущность этих методов и когда их применяют в данном случае? Приведите классификацию механизмов резистентности к антибиотикам и вы- берите наиболее опасную. никает в клетку, но подавления метаболизма не происходит) биотика в клетке концентрации антибиотика в клетке после его проникновения Это обусловлено появлением генов резистентности. Существенное место на фармацевтическом рынке занимают стероидные гормо- ны. Они не только жизненноважны, но и используются как ЛС большой широ- ты спектра и высокой избирательности физиологического воздействия. Приведите сравнительную характеристику наиболее ценных среоидных гормо- нов, связывая их структуру с учетом биотрансформации и фармакологической активностью. Представители стероидных гормонов: кортикостероиды, прогестогены, эстро- гены и андрогены. Биотрансформация (биоконверсия) позволяет превратить метаболиты синтеза микробных клеток в структурно родственные соединения. Общая черта био- трансформации – изменение именно молекулярной структуры трансформируе- мого вещества, что сложнее сделать химическим путем, а микроорганизмы со- вершают эти уникальные операции. Их сырьем могут быть стерины. Биотрансформация – аэробный процесс глубинной ферментации чаще с ис- пользованием грибов. Приведите ресурсы источников гормональных препаратов стероидной структу- ры, используемых в биотехнологическом производстве. Охарактеризуйте их. Определите роль и значение биотрансформации для получения данных препа- ратов. Для повышения синтеза вторичных метаболитов и увеличения выхода целевого продукта хороший эффект в биотехнологии дает метод иммобилизации био- объекта. Можете ли Вы представить какие-либо ограничения в ее применении. Ответ обоснуйте. Активность изолированного фермента всегда ниже активности целой клетки. необходимо повышать проницаемость оболочек или включать в гель живые клетки, осуществляющие многостадийные ферментативные процессы. Иммо- билизованные клетки дышат – поэтому необходима воздухопроницаемость. При установлении механизмов ферментативной инактивации аминогликозид- ных антибиотиков резистентными к ним бактериями, была осуществлена целе- направленная биотрансформация аминогликозидов с целью сделать их нечув- ствительными к инактивирующим ферментам. Представьте такую биотрансформацию аминогликозидных антибиотиков (на примере создания амикацина) как сочетание биосинтеза и оргсинтеза. Получают из канамицина, продуцируемым актиномицетами присоединяя био- на аминомасляную кислоту – повышается устойчивость и антибиотическая ак- тивность. На фармацевтическом рынке имеется большое количество полусинтетических пенициллинов. Определите целесообразность увеличения номенклатуры полусинтетических пенициллинов на примере цефамицина, имипенема, монобактама-азтреонама. Получение полусинтетических аминогликозидов связано с ферментативной ак- тивностью. Ферменты действуют на определенные структуры, а синтетические антибиоти- ки имеют измененную структуру, в связи с чем резистентности не наблюдается. При синтезе заменяют определенные остатки молекул с сохранением антибак- териальной активности и др. функциональные группы при этом теряется чувст- вительность к ферментам. Существует практическое применение продуктов клеточного синтеза, получен- ных в результате биотехнологии. Укажите эти продукты и способы их получения. Факты свидетельствуют, что избавиться от генов резистентности полностью невозможно, а это ослабляет позиции антибактериальных препаратов. Что такое гены резистентности? Какие мероприятия можно предложить в борьбе с антибиотикорезистентностью? Гены резистентности возникают в хромосоме или плазмиде бактериальной клетки как за- щитный механизм от воздействия антибиотика. Внехромосомные генетические элементы микробной клетки – концевые молекулы ДНК, имеющие размер в сотни раз меньше чеч хромосомы. Плазмиды, несущие ген резистентности, получили название R-плазмид. Основ- ная опасность резистентности в генетическом плане состоит в том, что плазмиды передаются из клетки в клетку коньюгацией (аналог полового процесса) – без деления клетки, однако плазмида при этом реплецируется. Мероприятия: изъятие антибиотика из клинической практики приведет к уменьшению распространения ге- нов резистентности и через некоторое время антибиотик и близкие к нему препараты восста- новят свою эффективность. Общая стратегия борьбы с антибиотикорезистентностью заключается в последовательной замене одних препаратов другими и возвращение старых препаратов по истечению опреде- ленного времени. Антибиотики, полученные методом БТ, имеют определенные физико-химические свойства, влияющие на метод их выделения и очистки. О каких физико-химических свойствах идет речь? Какие методы выделения и очистки антибиотиков можно предложить? К свойствам антибиотиков относят высокую их лабильность. Методы очистки антибиотиков: - экстракция органическими растворителями - ионный обмен - сорбционная очистка - мембранные технологии - фильтрация, центрифугирование, сеперация. В БТ получения антибиотиков существуют проблемы выделения и очистки. Какое влияние оказывает локализация антибиотиков и его реологические свойства? На стадии ферментации антибиотика культуральная жидкость содержит сам растворенный антибиотик, мицелий продуцента, продукты его лизиса, компоненты неиспользованной пи- тательной среды, неорганические соли. Иногда антибиотик содержится не только в культу- ральной жидкости, но и в мицелии, а культуральная жидкость обладает высокой вязкостью. Это вызывает определенные сложности при выделении антибиотика. При предварительной обработки отделяют мицелий и компоненты культуральной жидкости, находящиеся в колло- идном состоянии изменяя рН, иногда связанный с мицелием антибиотик объединяют в од- ном осадке из которого затем экстрагируют. Используют также фильтрацию и центрифуги- рование: барабанные вакуум-фильтры, фильтры-прессы и сперараторы различных конструк- ций. Современные ферментеры позволяют осуществлять дробную подачу отдельных компонен- тов питательной среды, которые определяют метаболическую активность культуры. Является ли процесс управляемым с т.з. классификации ферментации по материальным по- токам? Некоторые первичные метаболиты являются конечными продуктами разветвленного мета- болического пути. Одно ответвление заканчивается первичным метаболитом, другое – анти- биотиком. Что будет, если при биосинтезе беталактамного антибиотика в питательной среде будет из- быточное количество лизина. Альфааминоадипиновая кислота является, с одной стороны, прямым предшественником ли- зина (первичный метаболит), с другой стороны – беталактамного атибиотика, так как вклю- чается в исходный для его синтеза трипептид. При избытке лизина происходит подавление образования альфааминоадипиновой кислоты по принципу обратной связи и, таким образом, снижается синтез не только лизина, но и беталактамного антибиотика. Источники азота являются необходимыми компонентами питательной среды, но легко ути- лизируемые источники азота, усиливая рост продуцентов, отрицательно влияют на биосин- тез антибиотиков. Как не препятствуя росту биомассы не снижать активность продуцента? Добавление в питательную среду соевой или хлопковой муки, БВК (белково-витаминный концентрат) медленно расщепляются в процессе ферментации, т.е. из них медленно высво- бождаются аминокислоты и ионы аммония, поэтому их используют в качестве компонентов питательных сред, что позволяет получать высокий выход антибиотика. При биосинтезе антибиотиков должны присутствовать фосфаты, но в определенном количе- стве. Что будет, если при биосинтезе пенициллинов и цефалоспоринов фосфорные соединения (АТФ) будут в избытке? Как это объяснить на биохимическом уровне? Высокое содержание в среде фосфора в виде неорганических фосфатных солей неблагопри- ятно для синтеза большинства антибиотиков. Общая причина этого – обогащение клетки макроэнергетическими фосфорными соединениями (прежде всего АТФ), что повышает ско- рость роста мицелия. Накапливается много биомассы, но относительно мало антибиотика. Неблагоприятное действие фосфора на синтез беталактамных антибиотиков на биохимиче- ском уровне объясняется образованием LLD-трипептида – ключевого соединения, с которого Взаимодействие легкоокисляемого сахара и фосфора отрицательно влияет на биосинтез. Од- нако фосфор не может быть полностью исключен. Биосинтез снижается при его избытке, по- этому для каждого штамма подбирается его оптимальное количество. При биосинтезе антибиотиков необходимы источники углерода: глюкоза, фруктоза, сахаро- за, галактоза, крахмал, лактоза. Выберите оптимальный источник для синтеза беталактамных антибиотиков. Глюкоза – лучший источник углерода и энергии для любых организмов. Однако быстрый катаболизм глюкозы резко снижает биосинтез антибиотиков. Глюкоза ослабляет синтез бе- талактамов, аминогликозидов и др. антибиотиков, образуемых разными продуцентами. Глю- коза, фруктоза, сахароза и галактоза – сильные репрессоры этого процесса. Катаболизм глю- козы подавляет не активность ферментов биосинтеза антибиотиков, а сам синтез этих фер- ментов. Крахмал и другие медленно утилизирующиеся полисахариды, а также лактоза – бо- лее благоприятны для синтеза антибиотиков. Объясните явление катаболической репрессии при синтезе беталактамных антибиотиков. Катаболитная репрессия – явление «глюкозного эффекта», заключающееся в том, что глюко- за как наиболее быстро усваиваемый субстрат вызывает разной силы, но постоянную репрес- сию катаболических ферментов и в биотехнологическом производстве отрицательно влияет на синтез вторичных метаболитов - беталактамных антибиотиков. Определите роль генной инженерии в создании иммунобиопрепартатов. Иммунобиопрепараты – диагностические, профилактические и лекарственные средства с применением в качестве действующего начала разных агентов и процессов иммунной систе- мы. В качестве таких агентов используются микроорганизсы, белки, нуклеиновые кислоты, антибиотики, пестициды под названием «антигены». Иммунобиопрепаратами являются рекомбинантные вакцины, иммуносупрессоры, состоящие из комплекса рекомбинантных антигенов и носителей подавляющие специфический ответ на антиген; монокланальные антитела, полученные на основе рекомбинантной ДНК, иммуног- лабулины, диагностические тест-системы и др. ЛС, получение которых невозможно без ис- пользования методов генной инженерии. Приведите сравнительную характеристику глубинной и поверхностной ферментации анти- биотиков с т.з. развития промышленного способа производства и аппаратурного оформле- ния. При поверхностной ферментации биообъект растет только на поверхности жидкой питатель- ной среды и биомасса продуцента располагается в виде поверхностной пленки. А при глу- бинной ферментации работает весь объем питательной среды. Получается большое количе- ство биомассы и процесс глубиной ферментации считается высокоэкономичным. Всякий метаболит агрессивен по отношению к суперпродуценту (промышленному штамму). Как сохраняется жизнедеятельность суперпродуцента, обеспечивающего высокий выход це- левого продукта? В биотехнологии часто приходится защищать суперпродуцент от вырабатываемого в боль- шом количестве целевого продукта (первичных или вторичных метаболитов). Механизмы защиты: - при синтезе антибиотиков из актиномицетов защита продуцента осуществляется нали- чием в клетке метилазы – метилируется адениновый остаток рибосомальной РНК в ре- зультате негативное воздействие антибиотика на продуцент становится невозможным. - для защиты продуцента от циклопептидных антибиотиков используют «компартмента- цию», когда место синтеза антибиотика изолировано от чувствительных к нему метабо- лических реакций продуцирующей его клетки. - в основном же синтез антибиотика начинается уже после фазы роста мицелия и не отра- жается на его состоянии Природный штамм в отличие от промышленного продуцента малоэффективен. Как можно получить промышленный штамм? Методы получения промышленных штамов: - мутагенез и селекция - клеточная инженерия - генетическая инженерия Антибиотик (пенициллин, цефалоспорин) можно получить химическим синтезом и биосин- тезом. Что отличает химическую и биокаталитическую трансформацию получения беталактамных антибиотиков? В отличие от последовательных химических реакций, при синтезе антибиотиков - Биоката- путь связан с тем, что сборка молекулы происходит в мультиферментных комплексах с упо- рядоченно расположенными ферментами, при этом из комплекса выходит или завершенная молекула или ее крупный фрагмент. Второй путь – последовательные воздействия фермен- тов, катализирующих реакции метилирования, деметилирования, карбоксилирования, ами- нирования и др. К тетрациклину имеется высокий уровень резистентности (mDR). С т.з. скринига как объяснить эту ситуацию и предложите способы преодоления этого явле- ния. К беталактамным антибиотикам имеется высокий уровень резистентности (MRSA). С т.з. скринига как объяснить эту ситуацию и предложите способы преодоления этого явле- ния. При культивировании клеток Datura tatula была предложена питательная среда, содержащая микроэлементы, фитогормоны, источники углерода и углеводов. Достаточно ли этих компонентов, если целью БТ является усиление индукции деления клет- ки для увеличения выхода целевого продукта? Необходимы для координации роста клеток нитраты, ионы аммония, калия и фосфора. Для синтеза вторичных метаболитов весьма существенно внесение в питательную среду предше- ственников, стимулирующих определенные ферментативные пути метаболизма. Ферменты, участвующие в биотрансформации антибиотиков для получения новых веществ имеют определенные свойства, влияющие на процесс биоконверсии. гдролизом либо пенициллина, либо феноксиметилпенициллина с помощью фермента пини- циллиназы, который осуществляет гидролиз пенициллина по связи СО-NH (между радика- Какая связь между свойствами антибиотика и иммунитетом? Сродство у разных беталактамных молекул к разным транспептидазам получило название этому механизм действия разных беталактамных антибиотиков различен. Важность сведений большинству специалистов она не известна, так как еще мало изучена. Как микробиологическая трансформация гормональных ЛС стероидной структуры получила свое развитие при создании ЛС. В основе синтеза стероидных гормонов лежит биоконверсия, результатом применения кото- рой является превращение метаболитов в структурно родственные соединения под влиянием микроорганизмов или микробных клеток. Общей чертой является изменение молекулярной структуры трансформируемого вещества, а не синтез молекулы de novo. Причем реакции биотрансформации специфичны и определяются индуциабельными фер- ментами в строго определенной последовательности. Охарактеризуйте специфику БТ методов получения пробиотиков. Пробиотики – живые организмы микробного происхождения, которы при естественном вве- дении в организм благоприятно влияют на его физиологические функции. Получают их из штамма микроорганизма симбионта. Штамм должен быть непотогенен и не имет побочных эффектов. В БТ пробиотиков используют штаммы бифидо лактобактерий и энтерококков, а источником аминокислот – белок молока. Что такое система внутриклеточного транспорта и секреции конечных продуктов у микроор- ганизмов? При иммобилизации биообъектов если целевой продукт является внутриклеточным, то для его извлечения методами генной инженерии, чтобы не разрушать всю клетку, конструирует- ся и вводится в продуцент система транспорта. Для этого можно использовать специфиче- ские ферменты увеличивающие проницаемость клеточной стенки. Иногда для индукции внутриклеточного транспорта и секреции целевого продукта во внешнюю среду изменяют рН, температуру и некоторые другие условия, в которых будет протекать нужная фермента- тивная реакция. Для лечения инфекций используют комбинацию ампициллина с сульбактамом – «Уназин» и «Сультамициллин» - химическое соединение двух веществ. Какова необходимость создания таких соединений? Сульбактам является специфическим ингибитором беталактамаз, которые разрушают анти- биотик. Добавка ингибитора сохранят активность антибиотика. Большое распространение получил препарат смесь п/синтетического пенициллина – амокси- циллина с с клавулановой кислотой. Какова роль этих компонентов в преодолении резистентности? Клавулановая кислота является специфическим ингибитором беталактамаз, которые разру- шают антибиотик. Добавка ингибитора сохранят активность антибиотика. обеспечивает направления поиска создания новых антибиотиков? Какие свойства молекулы обеспечивают эффективность данного антибиотика? В структурной формуле цефамицина С присутствует метоксигруппа, что делает его эффек- тивным в отношении граммотрицательных бактерий, определяя высокую скорость прохож- дения через пористые каналы мембраны клетки. обеспечивает направления поиска создания новых антибиотиков? По каким направлениям осуществляется поиск новых ЛС? Сравните кривые роста микроорганизмов при получении первичных и вторичных метаболи- тов в БТ производстве. Первичные метаболиты необходимы для жизнедеятельности организма и кривая их роста возрастает в фазе роста биомассы. вторичные метаболиты, вещества не являющиеся обязательными для роста или функциони- рования клетки, но синтезирующиеся в стационарной фазе и участвующие в защите клеток от различных воздействий, причем они могут образовываться или при протекании разветв- ленных реакций, или из первичных метаболитов, при достаточном их количестве, что отра- жается на кривой их роста. В поиске и создании эффективных и безопасных ЛС отводится таргетному скринингу. Что это и как он работает? Успехи геномики и протеомики позволяют при использовании международных баз данных получать сведения о каждом гене водящем в геном объекта, получить любой ген в изолиро- ванном виде, копировать его с помощью ПЦР и на полученной таким образом матрице нара- батывать информационную РНК, а затем в бесклеточной рибосомной системе специфиче- ский для этого гена белок. Данный белок рассматривают как таргет, т.е. мишени для оценки на молекулярном уровне потенциальных биологических агентов как природных так и синте- тических соединений. используя такой метод скринига можно целенаправленно провести поиск ингибитора функций конкретного гена. В дальнейшем отобранные БАВ должны быть испытаны на клеточную проницаемость, достижение мишени, токсичности и т.д. Таргетный скрининг можно использовать при поиске генов вирулентности и создании ЛС. Каким образом в подготовительной стадии ферментационного процесса обеспечивается асептика производства? Асептика производства при организации процесса ферментации обеспечивается соблюдени- ем требований ГОСТ Р «Организация производства и контроля качества лекарственных средств» в отношении помещений, персонала, оборудования, воздуха, воды, питательных сред и т.п. Для этого проводят подготовку и стерилизацию технологического воздуха путем многократ- ной фильтрации. Проводят герметизацию и стерилизацию технологического оборудования и коммуникаций Проводят стерилизацию питательных сред Проанализируйте общие закономерности ферментационного процесса при синтезе антибио- тиков. Антибиотики не являются первичными метаболитами и каждый антибиотик играет специ- фическую роль в метаболизме своего продуцента. Процесс биосинтеза антибиотиков определяют следующие обстоятельства: - антибиотики не относятся к прямым продуктам трансляции или матричного синтеза - как вторичные вещества они образуются из первичных метаболитов - биосинтез молекулы антибиотика происходит с участием ряда ферментов - максимум концентрации антибиотика достигается, когда рост культуры завершатся или завершен - антибиотик синтезируется в местах клетки, отделенных от мест локализации жизненно важных метаболических процессов - после выхода антибиотика из мицелия обратно он не проникает, т.е. его транспорт имеет одностороннее направление - учитываются свойства продуцентов, которые в большинстве являются аэробами - биосинтезу антибиотиков способствует значительное уменьшение в питательной среде углерода и азота - и др. Объясните цели создания и механизм действия «антисмысловых олигонуклеотидов». Некоторые заболевания возникают при гиперпродукции функционального активного белка. Отсюда возникает задача подавления продукции такого белка. Т.е. необходимо избирательно подавлять экспрессию гена, кодирующего этот белок, или гена-фермента, участвующего в его модификации и превращения в активную форму. Для этого предложено получать ком- плиментарную для ДНК каждого гена (его участка) последовательность нуклеотидов, кото- рая за счет водородных связей будет реагировать с ДНК гена или информационной РНК. Данные инновационные ЛС получили общее название «антисмысловых олигонуклеотидов». Предложения для повышения выхода продуктов вторичного метаболизма применительно к растительным клеткам. Синтез вторичных метаболитов может коррелировать с процессом дифференцировки клеток. Стабильность синтеза вторичных метаболитов как целевого продукта зависит от стадии культивирования и дифференцировки Приведите перспективные варианты использования культур клеток в фарм. промышленно- сти. Промышленный синтез вторичных метаболитов на основе суспензионных культур клеток является перспективным и рентабельным, так как производство растительного сырья для не- го не зависит от климатических факторов, ни от повреждения насекомыми. Каллусные куль- туры выращиваются на малых площадях и в дальнейшем используются для синтеза соедине- ний всех классов. Причем выход вторичных метаболитов более высок чес синтез в целых растениях. Использование технологий получения каллусных культур дает преимущества надежности и стабильности выхода биомассы и продуктов вторичного метаболизма, а также возможность использования каллусной системы для иммобилизации с последующей биотрансформацией. Методы выделения и очистки ферментов в БТ производстве. Выделяют ферменты также, как и другие белки, хотя есть способы применимые именно к ферментам: - экстракция глицерином - метод ацетоновых порошков, заключающийся в осаждении и быстром обезвоживании - адсорбция с последующей элюцией с сорбента - афинная хроматография - ионообменная хроматография - и др. Иммобилизация в БТ производстве современных ЛС имеет много положительных парамет- ров. Какие это параметры производственного процесса? Существуют ли ограничения метода? Понятие иммобилизация означает физическое разделение биокатализатора и растворителя, при котором молекулы субстрата и продуктов реакции свободно проникать из жидкой среды в твердую и наоборот. Т.е. субстрат в токе растворителя подводится к бииобъекту, связанно- му с нерастворимым носителем, а продукт реакции в токе растворителя удаляется от биообъ- екта и используется как целевой продукт. В качестве нерастворимого носителя используют неорганические и органические вещества, как природные так и синтетические. Биообъект иммобилизируется на носителе: - адсорбцией - образованием ковалентных связей - включением в гель Ограничения: целевой продукт не должен являться внутриклеточным, иначе для его извле- чения придется разрушать всю систему. Какие рекомбинантные белки имеют наибольшее распространение на фарм. рынке? Рекомбинантные белки – и интерлейкины (группа белков системы передачи иммунного от- вета) и интерфероны – факторы врожденного иммунитета. Они индуцируют локальные и системные противоврирусные реакции в клетках и используются как противовирусные и противоопухолевые препараты. Их классифицируют на ,  и  (из разных типов клеток) Схема получения инсулина фирмы Eli Lilly.  Химический синтез генов, кодирующих образование цепей Аи В в определенной по- следовательности нуклеотидов  Конструирование вектора: - Внедрение каждого синтетического гена в плазмиду: в одну ген синтези- рующий цепь А, в другую – В - Для интенсификации репликации плазмид в каждую из них вводят ген, ко- дирующий образование фермента -галактозидазы - Введение полученных плазмид в клетку Escherichia coli с последующим получением двух культур продуцента, одна из которых синтезирует цепь А, другая В - Культуры клеток помещают в ферментер, в культуральную среду помещают галактозу, которая индуцирует образование фермента -галактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются и в результате получается большое количество генов, синтезирующих цепи А и В - Клетки лизируют, выделяя цепи А и В, которые обрабатывают бромцианом для отщепления от них -галактозидазы. - Затем следует очистка и выделение цепей А и В - Далее окисляют остатки цистеина и соединяют цепи А и В. Полученный генно-инженерный человеческий инсулин не вызывает ал- лергических реакций, так как он видоспецифичен, и если в нем находят какие то недопустимые примеси в виде эндотоксинов и пирогенов, то это относится только к нарушениям в технологии его изготовления и культуры производства. Механизмы регуляции экспрессии генов и их использование в БТ производстве ЛС? Механизмы регуляции экспрессии генов: транскрипция, трансляция и РНК-интерференция, а также используют еще один механизм – сплайсинг. Этот механизм используют в регуляции экспрессии изоформ VEGF в различных тканях человека. Укажите разницу между посевной и ферментационными средами. При поверхностной ферментации биообъект растет только на поверхности жидкой питатель- ной среды и биомасса продуцента располагается в виде поверхностной пленки. А при глу- бинной ферментации работает весь объем питательной среды. Получается большое количе- ство биомассы и процесс глубиной ферментации считается высокоэкономичным. Основной путь селекции продуцентов аминокислот – получение ауксотрофных и регулятор- ных мутантов. Какие используют микроорганизмы? Какими свойствами они должны обладать на генетическом уровне? При получении продуцентов аминокислот, таких как треонин или лизин, используют микро- организмы Escherichia coli, Corinebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Bacillus sub- tilis. В одном случае биосинтез аминокислот идет одновременно с ростом биомассы (одно- стадийный), в другом случае в начале рос биомассы, только потом синтез аминокислот. Альтернативных химическому синтезу служит микробиологический процесс, при котором специально подобранные селекционные или сконструированные методами генной инжене- рии штаммы продуценты способны осуществлять сверхсинтез аминокислот в значительных количествах, что является решающим фактором при выборе технологии в промышленном масштабе. Промышленный штамм должен обладать способностью к верхсинтезу. Для этой цели выби- рают полиауксотрофные мутанды, т.е. те клетки микроорганизмов, которые с одной стороны утратили способность самостоятельно синтезировать необходимые для роста и развития клетки различные аминокислоты, а с другой приобрели способность к синтезу целевой ами- нокислоты. Микроорганизмы осуществляют контроль биосинтеза каждой аминокислоты по принципу обратной связи как на уровне генов, ответственных за синтез соответствующих ферментов (репрессия), так и на уровне самих ферментов, способных при избытке аминокислоты изме- нять свою активность (ретроингибирование), что исключает перепроизводство аминокисло- ты в природных условиях. Целью биотехнолога является нарушение этих систем регуляции с дальнейшим отбором ауксотрофных мутантов на селективных средах с использованием му- тагенов (УФ, рентгеновские лучи, нитрозосоединения). Такие мутанты имеют в геноме де- фектный ген, детерминирующий фермент, без которого не может осуществляться биосинтез определенной аминокислоты. Получение ауксотрофных мутантов-подуцентов аминокислоты возможно только для микроорганизмов с разветвленной цепью биосинтеза. Охарактеризуйте методы получения вакцин. Вакцины (Vaccines) - препараты, предназначенные для создания активного иммунитета в ор- ганизме привитых людей или животных. Основным действующим началом каждой вакцины является иммуноген, т. е. корпускулярная или растворенная субстанция, несущая на себе хи- мические структуры, аналогичные компонентам возбудителя заболевания, ответственным за выработку иммунитета. При этом используют разные подходы: вирулентность, при этом сохраняется способность штамма вызывать иммунный ответ. По- лучаются живые вакцины, содержащие непатогенные микроорганизмы, которые не могут ревертировать и становиться патогенными. генных микроорганизмов, экспрессируют в альтернативном хозяине, например Е. coli, по- лучают нужный продукт в большом количестве и используют его как вакцину. Такие вак- цины, содержащие лишь отдельные компоненты патогенного микроорганизма, называют субъединичными вакцинами. ганизма, встраивают в геном микроорганизмов вакцину. Живые вакцины, как правило, бо- лее эффективны, чем неживые или субъединичные. непатогенного носителя (обычно виру- са) и получают живую безопасную, не содержащую болезнетворных В зависимости от природы иммуногена вакцины подразделяются на: бактерий или вирусов, сохраняющих в процессе изготовления свою целостность; пример - анатоксины) или его интегральных компонентов, т.н. субмикробные или субвири- онные вакцины; нов микроорганизма, наработанные в специальных клеточных системах; протективного белка, встроен в безвредный микроорганизм в расчете на то, что синтез этого белка будет происходить в организме привитого и, наконец, синтетические вакцины, где в качестве иммуногена используется хи- мический аналог протективного белка, полученный методом прямого химиче- ся химический аналог протективного белка, полученный методом прямого химического син- теза. Влияние глюкозы на синтез вторичных метаболитов в БТ производстве беталактамов. Глюкоза – лучший источник углерода и энергии для любых организмов. Однако быстрый катаболизм глюкозы резко снижает биосинтез антибиотиков. Глюкоза ослабляет синтез бе- талактамов, аминогликозидов и др. антибиотиков, образуемых разными продуцентами. Глю- коза, фруктоза, сахароза и галактоза – сильные репрессоры этого процесса. Катаболизм глю- козы подавляет не активность ферментов биосинтеза антибиотиков, а сам синтез этих фер- ментов. Что в БТ производстве влияет на выбор режима ферментации при получении ЛС. Примеры. Режимы ферментации подразделяют на периодические, полунепрерывные (регулируемые), непрерывные отъемно-доливные и многоциклические. Периодические процессы наиболее просты. Коррекция биосинтеза при такой ферментации не выполняется и выход целевого продукта не высок. Полунепрерывные более прогрессивны. Отъемно-доливной является промежуточным. Использование непрерывного процесса целесообразно в том случае, если целевым продук- том является непосредственно биомасса выращиваемого микроорганизма. Что следует учитывать при суспензионном культивировании растительных клеток? При внедрении такой технологии следует учитывать такие условия как температура, режим аэрации, способы перемешивания биомассы, асептика, дистанционное управление биореактором. В БТ производстве существует ли гарантия получения продуктов растительного происхож- дения с фармакологической активностью? Доказательства. Каким образом можно получить высокопродуктивный штамм микроорганизма? Методы получения высокопродуктивных штамов: мутагенез и селекция клеточная инженерия генетическая инженерия На фарм. рынке присутствуют диагностические тесты на основе моноклональных антител. Что это такое? Схема получения. Что означает явление репарации биообъекта? Как влияют предшественники на синтез вторичных метаболитов, если они являются целевы- ми продуктами биосинтеза? Что является регуляторами роста растений в БТ производстве, определяющими потенциаль- ную продуктивность культур клеток растений? Что необходимо для обеспечения роста и синтеза продуктов вторичного метаболизма при биосинтезе БАВ растительного происхождения? Докажите, что морфологическая спецификация клеток не является основной предпосылкой биосинтеза фармакологически активных веществ. Есть проблемы несоответствия высокого уровня микробиологических трансформаций и низ- кого выхода ферментационных процессов при получении гормональных стероидов. Как решить проблему? Методы получения сывороток БАВ растительного происхождения. Какие проблемы производства ЛС можно решить, внедряя культуры клеток растений в БТ? Не зависеть от погоды, природных условий, получать необходимое количество БАВ в про- мышленных масштабах сохраняя природные запасы лекарственных растений, получать ин- дивидуальные вещества или суммарные препараты не нарушая экологии выбросами и стока- ми, содержащими агрессивные химические вещества В каких случаях корневые каллусы красавки могут синтезировать ценные ЛС? Способность к синтезу вторичных метаболитов как целевого продукта зависит от стадии культивирования и дифференцировки клеток. Синтезировать метаболиты каллусы лишенные хлорофилла могут при наличии в питательной среде ауксинов: индолилуксусной кислоты, низмом первичного и вторичного метаболизма. При этом дифференцированные каллусы красавки будут синтезировать тропановые алкалоиды, а недифференцированные – нет. При производстве витаминов что является промышленным источников эргостерина? Какие условия ферментации? В качестве промышленного источника используют дрожжи Saccharomyces cerevisiae вслед- ствие высокого содержания в них эргостерина. В анаэробных условиях культивирования происходит накопление в клетках дрожжей сквалена (предшественника эргостерина), Ин- бытке углеводов и малом количестве азота. После спиртового брожения дрожжи отделяют от Значение тотипотентности при получении ЛС растительного происхождения. Тотипотентность – свойство клетки реализовывать генетическую информацию ядра, обеспе- чивающего развитие до целостного организма.


Внимание! Не забудьте ознакомиться с остальными документами данного пользователя!

Соседние файлы в текущем каталоге:

На сайте уже 21970 файлов общим размером 9.9 ГБ.

Наш сайт представляет собой Сервис, где студенты самых различных специальностей могут делиться своей учебой. Для удобства организован онлайн просмотр содержимого самых разных форматов файлов с возможностью их скачивания. У нас можно найти курсовые и лабораторные работы, дипломные работы и диссертации, лекции и шпаргалки, учебники, чертежи, инструкции, пособия и методички - можно найти любые учебные материалы. Наш полезный сервис предназначен прежде всего для помощи студентам в учёбе, ведь разобраться с любым предметом всегда быстрее когда можно посмотреть примеры, ознакомится более углубленно по той или иной теме. Все материалы на сайте представлены для ознакомления и загружены самими пользователями. Учитесь с нами, учитесь на пятерки и становитесь самыми грамотными специалистами своей профессии.

Не нашли нужный документ? Воспользуйтесь поиском по содержимому всех файлов сайта:



Каждый день, проснувшись по утру, заходи на obmendoc.ru

Товарищ, не ленись - делись файлами и новому учись!

Яндекс.Метрика